title: 14286388 - WT + 5CHO-THF roots Repet1 vs WT roots Repet1

description: Folates and 1C metabolism

hyb_protocol: WT roots Repet1 Cy5 / WT + 5CHO-THF roots Repet1 Cy3 : 30pmol. (Hybridization_Protocol.txt) Hybridization Protocol: CATMA slides (Corning Microarray Technology, CORNING) are pretreated in the prehybridisation solution (1 % BSA, 0.1 SDS, 5X SSC ) at 42°C for 60 min. They are dipped a couple of times in distilled water at room temperature, then in isopropanol and dried immediately by compressed nitrogen stream. Slides were placed in Corning hybridization chambers with a 25x60 lifterslip and 10ul of distilled water for each groove. The target was diluted to a final volume of 60 µL as follows 15µl of purified, labeled cDNA, 15 µl of 4X Hybridization Buffer ( 20X SDS, 0.4 % SDS), 30 µL formamide. The target mixture is heated for 3 min at 95°C, put on ice for 30 sec and centrifuged to remove dust for 1 min. The target mixture was put on the chip as quickly as possible. The microarray is sealed in a chamber and submerged in a 42°C water bath for approximately 16 h. The microarray is washed for 4 min in 1xSSC, 0.2% SDS (42°C); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC (RT); dipped a few times in distilled water and dried immediately by compressed nitrogen stream.

source_name: WT roots Repet1

extract_protocol: WT roots Repet1:10ug. (Amplification_Ambion.txt) Amplification des ARN messagers (Kit AMBION MessageAmp aRNA Amplification #1750) Le kit se compose de 3 parties : réactifs enzymatiques à -20°C, tampons de purification à 4°C et colonnes à température ambiante. Si les concentrations en ARN sont inférieures à 180 ng/µl, prévoir une précipitation. Transcription inverse A partir d'ARN totaux purifiés et quantifiés au Ribogreen : ARN tot (1µg)+ eau 5.5 µl T7-oligo-dT   0.5 µl Incuber dans le bloc chauffant à 65°C 10min, centrifuger brièvement , puis mettre sur glace. Préparer le Mix (prévoir 5% en plus) en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace :   10X First Strand Buffer :  1µl Ribonuclease Inhibitor :  0.5µl dNTP Mix :    2µl Reverse Transcriptase  0.5µl Ajouter 4 µl de ce mix dans les 6µl d'ARN, agiter légèrement et centrifuger brièvement. Volume final = 10 µl Incuber 2h dans un bain-marie à 42°C Centrifuger brièvement , puis mettre sur glace Allumer le bain-Marie à 16°C dans la chambre froide. Faire un mix dans cet ordre (prévoir 5% en plus) en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace: Eau RNase-Free  31.5µl 10X 2nd Strand Buffer 5µl dNTP Mix    2µl DNA Polymérase  1µl RNase H.     0.5µl Ajouter 40 µl de ce mix aux 10 µl précédents. Volume final = 50 µl. Mélanger par pipetage et centrifuger brièvement. Incuber 2h à 16°C Ajouter 50 µl d'eau DEPC. Possibilité de garder les échantillons après cette étape à -20°C en attendant la purification Purification des cDNA: cette étape doit se faire le plus tard possible Allumer un bain-Marie et le régler à 50 °C. Y mettre l'eau RNase-free à préchauffer. À 4 °C, le Binding Buffer peut avoir cristallisé, il faut bien le redissoudre avant utilisation en le chauffant brièvement au bain marie à 50°C. Equilibrer la colonne: déposer 50 µl de cDNA Binding Buffer sur la colonne cDNA Incuber 5 min à température ambiante. (Ne pas centrifuger) Ajouter 250µl de cDNA Binding Buffer dans les 100µl d'[ADN + eau] Mélanger par pipetage Déposer le tout sur la colonne équilibrée Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube 2 ml Lavage : déposer 500 µl de cDNA Wash Buffer sur la colonne (Vérifier que l'éthanol a bien été ajouté) Centrifuger 1 minute à 10000g à température ambiante Jeter le liquide et centrifuger à nouveau 1 minute à 10 000g afin d'éliminer les traces d'éthanol Transférer colonne dans un tube de 1.5 ml Déposer au milieu de la colonne 5µl d'eau RNase-free à 50°C Incuber 2 minutes à température ambiante et remettre l'eau à 50°C Centrifuger 1,5 minutes à 10000g à température ambiante Répéter l'élution dans le même tube avec 5µl d'eau RNase-free à 50°C et éteindre le bain-marie Transcription in vitro pour la synthèse d'aRNA(prévoir 5% en plus) : Préparer le mix suivant en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace : 2µl ATP Soln (75mM) 2µl CTP Soln (75mM) 2µl GTP Soln (75mM) 2µl UTP Soln (75mM) 2µl T7 10X réaction Buffer Attention : il peut avoir cristallisé : bien le redissoudre avant utilisation 2µl T7 enzyme Mix Mélanger par pipetage, centrifugation brève Ajouter 12 µl de ce mix dans les 8 µl précédents. Volume final = 20 µl Incuber 14h dans l'étuve "bactério" à 37°C. Rajouter 1 µl de DNase I, mélanger par pipetage, centrifugation brève Incuber 30min dans le bloc chauffant à 37°C. Possibilité de conserver à -20°C avant la purification Ajouter 80 µl "Elution Solution" à l'éluat. Vf = 100µl. Purification des aRNA : Allumer un bain-Marie et le régler à 50 °C. Y mettre l'eau RNase-free à préchauffer. Ajouter aux 100 µl précédents :  350µl aRNA Binding Buffer  250µl EtOH 100%. Mélanger par pipetage et déposer l'échantillon sur le centre de la colonne aRNA Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube de 2 ml Lavage : déposer 650µl aRNA Wash Buffer sur la colonne (Vérifier que l'éthanol a bien été ajouté) Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et centrifuger à nouveau 1 minute à 10 000g afin d'éliminer les traces d'éthanol Transférer la colonne dans un tube de 1.5 ml Elution : déposer au milieu de la colonne 50µl d'eau RNase-free à 50°C Incuber 2 minutes à température ambiante et remettre l'eau à 50°C Centrifuger 1,5 minutes à 10 000g à température ambiante Répéter l'élution dans le même tube : Déposer au milieu de la colonne 50µl d'eau RNase-free à 50°C et éteindre le bain-marie Incuber 2 minutes à température ambiante Centrifuger 1,5 minutes à 10 000g à température ambiante Le volume final est entre 90 et 100 µl. Quantification : Préparer une dilution au 1/20 pour chaque échantillon et quantifier au ribogreen. Si la quantité finale est inférieure à 50 µg, vérifier la qualité sur gel (ou puce Bio-Analyser.) Si la concentration est inférieure à 625 ng/µl, prévoir une précipitation pour le marquage : Ajouter 10 µl de Na Acetate 3M, pH 5,2 et 250 µl d'Ethanol 96,2% Précipiter 1 heure à -20°C ou 30 minutes à -80°C Centrifuger 30 minutes 13 000 rpm à 4°C Vider le surnageant et laver le culot avec 500 µl d'éthanol à 70 % Centrifuger 5 minutes à 13 000 rpm à 4°C et pipeter le surnageant Laisser le culot sécher à l'air libre sur glace pendant 15 minutes Resuspendre avec de l'eau RNase-free à une concentration de 1 µg/µl.

source_name: WT + 5CHO-THF roots Repet1

extract_protocol: WT + 5CHO-THF roots Repet1:10ug. (Amplification_Ambion.txt) Amplification des ARN messagers (Kit AMBION MessageAmp aRNA Amplification #1750) Le kit se compose de 3 parties : réactifs enzymatiques à -20°C, tampons de purification à 4°C et colonnes à température ambiante. Si les concentrations en ARN sont inférieures à 180 ng/µl, prévoir une précipitation. Transcription inverse A partir d'ARN totaux purifiés et quantifiés au Ribogreen : ARN tot (1µg)+ eau 5.5 µl T7-oligo-dT   0.5 µl Incuber dans le bloc chauffant à 65°C 10min, centrifuger brièvement , puis mettre sur glace. Préparer le Mix (prévoir 5% en plus) en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace :   10X First Strand Buffer :  1µl Ribonuclease Inhibitor :  0.5µl dNTP Mix :    2µl Reverse Transcriptase  0.5µl Ajouter 4 µl de ce mix dans les 6µl d'ARN, agiter légèrement et centrifuger brièvement. Volume final = 10 µl Incuber 2h dans un bain-marie à 42°C Centrifuger brièvement , puis mettre sur glace Allumer le bain-Marie à 16°C dans la chambre froide. Faire un mix dans cet ordre (prévoir 5% en plus) en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace: Eau RNase-Free  31.5µl 10X 2nd Strand Buffer 5µl dNTP Mix    2µl DNA Polymérase  1µl RNase H.     0.5µl Ajouter 40 µl de ce mix aux 10 µl précédents. Volume final = 50 µl. Mélanger par pipetage et centrifuger brièvement. Incuber 2h à 16°C Ajouter 50 µl d'eau DEPC. Possibilité de garder les échantillons après cette étape à -20°C en attendant la purification Purification des cDNA: cette étape doit se faire le plus tard possible Allumer un bain-Marie et le régler à 50 °C. Y mettre l'eau RNase-free à préchauffer. À 4 °C, le Binding Buffer peut avoir cristallisé, il faut bien le redissoudre avant utilisation en le chauffant brièvement au bain marie à 50°C. Equilibrer la colonne: déposer 50 µl de cDNA Binding Buffer sur la colonne cDNA Incuber 5 min à température ambiante. (Ne pas centrifuger) Ajouter 250µl de cDNA Binding Buffer dans les 100µl d'[ADN + eau] Mélanger par pipetage Déposer le tout sur la colonne équilibrée Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube 2 ml Lavage : déposer 500 µl de cDNA Wash Buffer sur la colonne (Vérifier que l'éthanol a bien été ajouté) Centrifuger 1 minute à 10000g à température ambiante Jeter le liquide et centrifuger à nouveau 1 minute à 10 000g afin d'éliminer les traces d'éthanol Transférer colonne dans un tube de 1.5 ml Déposer au milieu de la colonne 5µl d'eau RNase-free à 50°C Incuber 2 minutes à température ambiante et remettre l'eau à 50°C Centrifuger 1,5 minutes à 10000g à température ambiante Répéter l'élution dans le même tube avec 5µl d'eau RNase-free à 50°C et éteindre le bain-marie Transcription in vitro pour la synthèse d'aRNA(prévoir 5% en plus) : Préparer le mix suivant en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace : 2µl ATP Soln (75mM) 2µl CTP Soln (75mM) 2µl GTP Soln (75mM) 2µl UTP Soln (75mM) 2µl T7 10X réaction Buffer Attention : il peut avoir cristallisé : bien le redissoudre avant utilisation 2µl T7 enzyme Mix Mélanger par pipetage, centrifugation brève Ajouter 12 µl de ce mix dans les 8 µl précédents. Volume final = 20 µl Incuber 14h dans l'étuve "bactério" à 37°C. Rajouter 1 µl de DNase I, mélanger par pipetage, centrifugation brève Incuber 30min dans le bloc chauffant à 37°C. Possibilité de conserver à -20°C avant la purification Ajouter 80 µl "Elution Solution" à l'éluat. Vf = 100µl. Purification des aRNA : Allumer un bain-Marie et le régler à 50 °C. Y mettre l'eau RNase-free à préchauffer. Ajouter aux 100 µl précédents :  350µl aRNA Binding Buffer  250µl EtOH 100%. Mélanger par pipetage et déposer l'échantillon sur le centre de la colonne aRNA Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube de 2 ml Lavage : déposer 650µl aRNA Wash Buffer sur la colonne (Vérifier que l'éthanol a bien été ajouté) Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et centrifuger à nouveau 1 minute à 10 000g afin d'éliminer les traces d'éthanol Transférer la colonne dans un tube de 1.5 ml Elution : déposer au milieu de la colonne 50µl d'eau RNase-free à 50°C Incuber 2 minutes à température ambiante et remettre l'eau à 50°C Centrifuger 1,5 minutes à 10 000g à température ambiante Répéter l'élution dans le même tube : Déposer au milieu de la colonne 50µl d'eau RNase-free à 50°C et éteindre le bain-marie Incuber 2 minutes à température ambiante Centrifuger 1,5 minutes à 10 000g à température ambiante Le volume final est entre 90 et 100 µl. Quantification : Préparer une dilution au 1/20 pour chaque échantillon et quantifier au ribogreen. Si la quantité finale est inférieure à 50 µg, vérifier la qualité sur gel (ou puce Bio-Analyser.) Si la concentration est inférieure à 625 ng/µl, prévoir une précipitation pour le marquage : Ajouter 10 µl de Na Acetate 3M, pH 5,2 et 250 µl d'Ethanol 96,2% Précipiter 1 heure à -20°C ou 30 minutes à -80°C Centrifuger 30 minutes 13 000 rpm à 4°C Vider le surnageant et laver le culot avec 500 µl d'éthanol à 70 % Centrifuger 5 minutes à 13 000 rpm à 4°C et pipeter le surnageant Laisser le culot sécher à l'air libre sur glace pendant 15 minutes Resuspendre avec de l'eau RNase-free à une concentration de 1 µg/µl.

treatment_protocol: Name:5-Formyl-THF supplemented - compound based treatment - compound addition,5-formyl-thf:quantity 500uM time 17day . Arabidopsis thaliana were seeded after cold treatment (3 days) and grown for 17 days in MS media with different treatments in growth room. After this time shoots and roots were collected and separated with a razor blade, flash frozen with liquid nitrogen and stored at -80ºC for further RNA extraction.


title: 14286389 - WT roots Repet1 vs WT + MTX roots Repet1

status: Public on Aug 01 2013

type: RNA

city: evry

first: Soubigou-Taconnat

last: Ludivine

address: 2 rue gaston crémieux

department: URGV

country: France

institute: INRA

description: Folates and 1C metabolism

hyb_protocol: WT + MTX roots Repet1 Cy5 / WT roots Repet1 Cy3 : 30pmol. (Hybridization_Protocol.txt) Hybridization Protocol: CATMA slides (Corning Microarray Technology, CORNING) are pretreated in the prehybridisation solution (1 % BSA, 0.1 SDS, 5X SSC ) at 42°C for 60 min. They are dipped a couple of times in distilled water at room temperature, then in isopropanol and dried immediately by compressed nitrogen stream. Slides were placed in Corning hybridization chambers with a 25x60 lifterslip and 10ul of distilled water for each groove. The target was diluted to a final volume of 60 µL as follows 15µl of purified, labeled cDNA, 15 µl of 4X Hybridization Buffer ( 20X SDS, 0.4 % SDS), 30 µL formamide. The target mixture is heated for 3 min at 95°C, put on ice for 30 sec and centrifuged to remove dust for 1 min. The target mixture was put on the chip as quickly as possible. The microarray is sealed in a chamber and submerged in a 42°C water bath for approximately 16 h. The microarray is washed for 4 min in 1xSSC, 0.2% SDS (42°C); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC (RT); dipped a few times in distilled water and dried immediately by compressed nitrogen stream.

scan_protocol: GenePix Pro 3.0, Cy3:pmt voltage 532nm,480V,laser power 35%, Cy5:635nm,pmt voltage 480V,laser power 30%

data_processing: The raw data comprised the logarithm of median feature pixel intensity at wavelength 635 nm (red) and 532 nm (green). No background was subtracted. An array-by-array normalization was performed to remove systematic biases. First, we excluded spots that were considered badly formed features by the experimenter (Flags=-100). Then we performed a global intensity-dependent normalization using the loess procedure (see Yang et al., 2002) to correct the dye bias. Finally, on each block, the log-ratio median is subtracted from each value of the log-ratio of the block to correct a print-tip effect on each metablock.

molecule: total RNA

organism: Arabidopsis thaliana

source_name: WT + MTX roots Repet1

label_protocol: labelling Cy3 and Cy5 direct, amplification=yes, aRNA 5 ug. (Labelling_protocol.txt) Labelling protocol: 5 µg of aRNA (8µl) mixed with 2 µl of random nonamers 1µg/µl and 0.5 µl of RNAse Out 40 U/µl, denatured 10 min at 70 °C and chilled on ice. The followig components were added to the sample 4 µl of first strand buffer 5 X, 1 µl of 10 mM dNTP/2mM dCTP, 2 µl of 0.1 M DTT, 1.5 µl of Cy3-dCTP or Cy5-dCTP (Amersham Pharmacia Biotech, 25nmol tube, PA5502), 1 µl of SuperScript II RT 200U/µl. Then it was incubated at 42°C for 2.5 hours and chilled on ice. The sample was denaturated by adding 2 µl of NaOH 2.5M and incubated at 37 °C for exactly 15 min, then was added 10 µl of 2M MOPS and put on ice. The dyes were purified with the QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN).

growth_protocol: roots - Media=Murashige and Skoog medium (pH 5.7) containing 1% (w/v) Suc, phytagar (0.5%–1%), and vitamins pyridoxine-HCl, nicotinic acid (0.5 mg/mL), and thiamine (1 mg/mL). Plates were incubated vertically in a growth room. For 5-Formyl-THF [(6S)-5-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid, calcium salt; natural calciumfolinate; Schircks Laboratories] and Methotrexate [(2S)-2-[(4-{[(2,4-diaminopteridin-6-yl)methyl](methyl)amino}phenyl)formamido]pentanedioic acid; Schircks Laboratories] supplementation, stock solutions were applied to the growth medium to achieve the desired working concentration. hygrometry- Temperature=19ºCNight-22ºCDay Light=120-140 mmol photons m2/s

extract_protocol: WT + MTX roots Repet1:10ug. (Amplification_Ambion.txt) Amplification des ARN messagers (Kit AMBION MessageAmp aRNA Amplification #1750) Le kit se compose de 3 parties : réactifs enzymatiques à -20°C, tampons de purification à 4°C et colonnes à température ambiante. Si les concentrations en ARN sont inférieures à 180 ng/µl, prévoir une précipitation. Transcription inverse A partir d'ARN totaux purifiés et quantifiés au Ribogreen : ARN tot (1µg)+ eau 5.5 µl T7-oligo-dT   0.5 µl Incuber dans le bloc chauffant à 65°C 10min, centrifuger brièvement , puis mettre sur glace. Préparer le Mix (prévoir 5% en plus) en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace :   10X First Strand Buffer :  1µl Ribonuclease Inhibitor :  0.5µl dNTP Mix :    2µl Reverse Transcriptase  0.5µl Ajouter 4 µl de ce mix dans les 6µl d'ARN, agiter légèrement et centrifuger brièvement. Volume final = 10 µl Incuber 2h dans un bain-marie à 42°C Centrifuger brièvement , puis mettre sur glace Allumer le bain-Marie à 16°C dans la chambre froide. Faire un mix dans cet ordre (prévoir 5% en plus) en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace: Eau RNase-Free  31.5µl 10X 2nd Strand Buffer 5µl dNTP Mix    2µl DNA Polymérase  1µl RNase H.     0.5µl Ajouter 40 µl de ce mix aux 10 µl précédents. Volume final = 50 µl. Mélanger par pipetage et centrifuger brièvement. Incuber 2h à 16°C Ajouter 50 µl d'eau DEPC. Possibilité de garder les échantillons après cette étape à -20°C en attendant la purification Purification des cDNA: cette étape doit se faire le plus tard possible Allumer un bain-Marie et le régler à 50 °C. Y mettre l'eau RNase-free à préchauffer. À 4 °C, le Binding Buffer peut avoir cristallisé, il faut bien le redissoudre avant utilisation en le chauffant brièvement au bain marie à 50°C. Equilibrer la colonne: déposer 50 µl de cDNA Binding Buffer sur la colonne cDNA Incuber 5 min à température ambiante. (Ne pas centrifuger) Ajouter 250µl de cDNA Binding Buffer dans les 100µl d'[ADN + eau] Mélanger par pipetage Déposer le tout sur la colonne équilibrée Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube 2 ml Lavage : déposer 500 µl de cDNA Wash Buffer sur la colonne (Vérifier que l'éthanol a bien été ajouté) Centrifuger 1 minute à 10000g à température ambiante Jeter le liquide et centrifuger à nouveau 1 minute à 10 000g afin d'éliminer les traces d'éthanol Transférer colonne dans un tube de 1.5 ml Déposer au milieu de la colonne 5µl d'eau RNase-free à 50°C Incuber 2 minutes à température ambiante et remettre l'eau à 50°C Centrifuger 1,5 minutes à 10000g à température ambiante Répéter l'élution dans le même tube avec 5µl d'eau RNase-free à 50°C et éteindre le bain-marie Transcription in vitro pour la synthèse d'aRNA(prévoir 5% en plus) : Préparer le mix suivant en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace : 2µl ATP Soln (75mM) 2µl CTP Soln (75mM) 2µl GTP Soln (75mM) 2µl UTP Soln (75mM) 2µl T7 10X réaction Buffer Attention : il peut avoir cristallisé : bien le redissoudre avant utilisation 2µl T7 enzyme Mix Mélanger par pipetage, centrifugation brève Ajouter 12 µl de ce mix dans les 8 µl précédents. Volume final = 20 µl Incuber 14h dans l'étuve "bactério" à 37°C. Rajouter 1 µl de DNase I, mélanger par pipetage, centrifugation brève Incuber 30min dans le bloc chauffant à 37°C. Possibilité de conserver à -20°C avant la purification Ajouter 80 µl "Elution Solution" à l'éluat. Vf = 100µl. Purification des aRNA : Allumer un bain-Marie et le régler à 50 °C. Y mettre l'eau RNase-free à préchauffer. Ajouter aux 100 µl précédents :  350µl aRNA Binding Buffer  250µl EtOH 100%. Mélanger par pipetage et déposer l'échantillon sur le centre de la colonne aRNA Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube de 2 ml Lavage : déposer 650µl aRNA Wash Buffer sur la colonne (Vérifier que l'éthanol a bien été ajouté) Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et centrifuger à nouveau 1 minute à 10 000g afin d'éliminer les traces d'éthanol Transférer la colonne dans un tube de 1.5 ml Elution : déposer au milieu de la colonne 50µl d'eau RNase-free à 50°C Incuber 2 minutes à température ambiante et remettre l'eau à 50°C Centrifuger 1,5 minutes à 10 000g à température ambiante Répéter l'élution dans le même tube : Déposer au milieu de la colonne 50µl d'eau RNase-free à 50°C et éteindre le bain-marie Incuber 2 minutes à température ambiante Centrifuger 1,5 minutes à 10 000g à température ambiante Le volume final est entre 90 et 100 µl. Quantification : Préparer une dilution au 1/20 pour chaque échantillon et quantifier au ribogreen. Si la quantité finale est inférieure à 50 µg, vérifier la qualité sur gel (ou puce Bio-Analyser.) Si la concentration est inférieure à 625 ng/µl, prévoir une précipitation pour le marquage : Ajouter 10 µl de Na Acetate 3M, pH 5,2 et 250 µl d'Ethanol 96,2% Précipiter 1 heure à -20°C ou 30 minutes à -80°C Centrifuger 30 minutes 13 000 rpm à 4°C Vider le surnageant et laver le culot avec 500 µl d'éthanol à 70 % Centrifuger 5 minutes à 13 000 rpm à 4°C et pipeter le surnageant Laisser le culot sécher à l'air libre sur glace pendant 15 minutes Resuspendre avec de l'eau RNase-free à une concentration de 1 µg/µl.

treatment_protocol: Name:Methotrexate supplemented - compound based treatment - compound addition,methotrexate:quantity 5nM time 17day . Arabidopsis thaliana were seeded after cold treatment (3 days) and grown for 17 days in MS media with different treatments in growth room. After this time shoots and roots were collected and separated with a razor blade, flash frozen with liquid nitrogen and stored at -80ºC for further RNA extraction.

tag: ecotype

value: columbia

tag: genotype/variation

value: wild type

tag: treatment

value: MTX

tag: tissue

value: roots

tag: dev.stage (boyes et al. plant cell 2001)

treatment_protocol: no treatment


title: HMEC_90% confluent_25µg/mL_of_ENP_rep3

city: Nancy

first: Bertrand

last: Rihn

address: 5 rue A Lebrun

department: Faculté de Pharmacie

institute: Université de Lorraine

description: Gene expression in HMEC at 90 % of confluence after 24 h in presence of ENP exposure (25 µg/mL)

hyb_protocol: 600 ng of CTP-Cy3-labelled cRNA (specific activity > 10.0 pmol Cy3/µg cRNA) was fragmented at 60°C for 30 min in a reaction volume of 25 µl containing 25 x Agilent fragmentation buffer and 10 x Agilent blocking agent following the manufacturers instructions. On completion of the fragmentation reaction, 25 µl of 2 x Agilent hybridization buffer were added to the fragmentation mixture and hybridized to SurePrint G3 Human GE v2 8x60K (Agilent) for 17 h at 65°C in a rotating hybridization oven. After hybridization, microarrays were washed 1 min at room temperature with GE Wash Buffer 1 (Agilent) and 1 min with 37°C GE Wash buffer 2 (Agilent), then dried immediately by brief passage in acetonitrile.

scan_protocol: Slides were scanned immediately after washing on the Agilent DNA Microarray Scanner (G2565CA) using one color scan setting for 8x60k array slides: scan area was 61x21.6 mm, scan resolution 3 µm, dye channel was set to Green, Tiff file dynamic range was 20 bits and Green PMT was set to 100 %.

data_processing: The scanned images were analyzed with Feature Extraction version 10.10.1.1 (Agilent) using default parameters (protocol GE1_1010_Sep10 and Grid: 039494_D_F_20120628) to obtain background subtracted and spatially detrended processed signal intensities. Features flagged in Feature Extraction as Feature Non-uniform outliers were excluded.

organism: Homo sapiens

source_name: HMEC, 90 % confluent, 25 µg/mL of ENP, replicate 3

label_protocol: CTP-cyanine-3 (Cy3) labeled cRNA was prepared from 100 ng RNA using the One-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis (Agilent, version 6.6) according to manufacturer's instructions, followed by RNeasy column purification (RNeasy Mini kit, QIAGEN). Dye incorporation and cRNA yield and quality were checked by spectrophotometry (Nanodrop ND1000, Labtech) and with the Agilent 2100 Bioanalyser.

growth_protocol: Human mammary epithelial cells (HMEC 184) is a 10-25 % luminal-like and 75-90 % basal-like breast cell line at prestasis with finite lifespan. It was established and described by Martha R Stampfer (Stampfer MR, Bodnar A, Garbe J, Wong M, Pan A, Villeponteau B, Yaswen P. Gradual phenotypic conversion associated with immortalization of cultured human mammary epithelial cells. Mol Biol Cell. 1997 8:2391-405). Cells were grown in M87A+CT+GFX medium containing (i) 50 % mammary epithelial basal medium (supplemented with 5 mg/ml insulin, 70 µg/ml bovine pituitary extract, 0.5 µg/ml hydrocortisone, 5 ng/ml EGF, 5 µg/ml transferrin, 10-5 M isoproterenol, 2 nM glutamine), (ii) 50 % DMEM/F12 (supplemented with 10 µg/ml insulin, 10 nM tri-iodothyronine, 1 nM β-estradiol, 0.1 µg/ml hydrocortisone, 0.5 % fetal calf serum, 5 ng/ml EGF, 2 mM glutamine, and 1 ng/ml cholera toxin), with (iii) 0.1 nM oxytocin and 0.1 % lipid-rich bovine serum albumin (albuMaxI). Cells were grown in 5 % CO2 atmosphere at 37°C.

extract_protocol: The quality of the RNA extracted with RiboPure kit (Ambion, Austin, TX) was determined by spectrophotometry (A260nm/A280nm > 1.8, BioSpec-nano, Shimadzu) and capillary electrophoresis using RNA 6000 Nano (RIN > 7, Agilent 2100 Bioanalyser™).

treatment_protocol: HMEC 184 cells (90% confluence) were incubated with polymeric Eudragit RS nanoparticles (ENP; 25 µg/mL) for 24h, and without incubation (control) in a T.C. incubator at 37°C and 5% CO2.

value: mammary epithelial cells

tag: gender

value: female

tag: age

value: 25 ug/ml Eudragit RS nanoparticles

tag: cell line

value: HMEC 184


title: gaiGR, 1h mock-treated, biological replicate 2

city: Gent

first: Hannes

last: Claeys

address: Technologiepark 927

department: Plant Systems Biology

country: Belgium

institute: VIB-UGent

hyb_protocol: Standard Affymetrix protocol

scan_protocol: Standard Affymetrix protocol

data_processing: Data was processed with Robust Multichip Average (RMA) (background correction, normalization, and summarization) as implemented in BioConductor (Irizarry et al., 2003a; Irizarry et al., 2003b; Gentleman et al., 2004).

label: biotin

label_protocol: Standard Affymetrix protocol

growth_protocol: plant were grown on MS medium under 16 h light/ 8 h dark cycle at 21°C

extract_protocol: RNeasy plant mini kit (Qiagen), according to manufacturer protocol

treatment_protocol: Plant were transferred to MS medium containing 5 uM dexamethason or DMSO (mock) for 1 to 4 hours

value: leaf 3

value: mock

tag: genotype

tag: time

value: 1 h


title: 14286391 - WT + MTX roots Repet1 vs WT roots Repet1

description: Folates and 1C metabolism

hyb_protocol: WT roots Repet1 Cy5 / WT + MTX roots Repet1 Cy3 : 30pmol. (Hybridization_Protocol.txt) Hybridization Protocol: CATMA slides (Corning Microarray Technology, CORNING) are pretreated in the prehybridisation solution (1 % BSA, 0.1 SDS, 5X SSC ) at 42°C for 60 min. They are dipped a couple of times in distilled water at room temperature, then in isopropanol and dried immediately by compressed nitrogen stream. Slides were placed in Corning hybridization chambers with a 25x60 lifterslip and 10ul of distilled water for each groove. The target was diluted to a final volume of 60 µL as follows 15µl of purified, labeled cDNA, 15 µl of 4X Hybridization Buffer ( 20X SDS, 0.4 % SDS), 30 µL formamide. The target mixture is heated for 3 min at 95°C, put on ice for 30 sec and centrifuged to remove dust for 1 min. The target mixture was put on the chip as quickly as possible. The microarray is sealed in a chamber and submerged in a 42°C water bath for approximately 16 h. The microarray is washed for 4 min in 1xSSC, 0.2% SDS (42°C); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC (RT); dipped a few times in distilled water and dried immediately by compressed nitrogen stream.


title: Go_ siRNA

city: fukuoka

first: naoya

last: matsunaga

address: maidashi 3-1-1, higashi-ku

country: Japan

institute: kyushu university

hyb_protocol: 1.5 ug of Cy3-labelled cRNA was fragmented at 60°C for 30 minutes in a reaction volume of 250 ml containing 1x Agilent fragmentation buffer and 2x Agilent blocking agent following the manufacturers instructions. On completion of the fragmentation reaction, 250 ml of 2x Agilent hybridization buffer was added to the fragmentation mixture and hybridized to Agilent Whole Human Genome Oligo Microarrays (G4112F) for 17 hours at 65°C in a rotating Agilent hybridization oven.  After hybridization, microarrays were washed 1 minute at room temperature with GE Wash Buffer 1 (Agilent) and 1 minute with 37Â°C GE Wash buffer 2 (Agilent), then dried immediately by brief centrifugation.

scan_protocol: Slides were scanned immediately after washing on the Agilent DNA Microarray Scanner (G2505B) using one color scan setting for 1x44k array slides (Scan Area 61x21.6 mm, Scan resolution 10um, Dye channel is set to Green and Green PMT is set to 100%).

data_processing: The scanned images were analyzed with Feature Extraction Software (Agilent) using default parameters to obtain background subtracted and spatially detrended Processed Signal intensities.

organism: Mus musculus

source_name: primary hepatocyte, G0s2 siRNA

label_protocol: Cyanine-3 (Cy3) labeled cRNA was prepared from 0.5 ug RNA using the One-Color Low RNA Input Linear Amplification PLUS kit (Agilent) according to the manufacturer's instructions, followed by RNAeasy column purification (QIAGEN, Valencia, CA).  Dye incorporation and cRNA yield were checked with the NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer.

growth_protocol: The cells were maintained in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) (Sigma Aldrich; St. Louis, MO) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) (Moregate Biotech; Bulimba, Australia) at 37°C in a humidified 5% CO2 atmosphere.

extract_protocol: Total RNA was extracted using theTRIzol .

treatment_protocol: Cells were plated on 24-well plates at a density of 1×105 cells per well. StealthTM RNA were designed by Invitrogen Life Technologies. G0s2 siRNA (50 pmol) or control siRNA (50 pmol) were transfected into the cells using Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

tag: cell type

value: primary hepatocyte

tag: transfected with

value: G0s2 siRNA


title: 14286387 - WT roots Repet1 vs WT + 5CHO-THF roots Repet1

description: Folates and 1C metabolism

hyb_protocol: WT + 5CHO-THF roots Repet1 Cy5 / WT roots Repet1 Cy3 : 30pmol. (Hybridization_Protocol.txt) Hybridization Protocol: CATMA slides (Corning Microarray Technology, CORNING) are pretreated in the prehybridisation solution (1 % BSA, 0.1 SDS, 5X SSC ) at 42°C for 60 min. They are dipped a couple of times in distilled water at room temperature, then in isopropanol and dried immediately by compressed nitrogen stream. Slides were placed in Corning hybridization chambers with a 25x60 lifterslip and 10ul of distilled water for each groove. The target was diluted to a final volume of 60 µL as follows 15µl of purified, labeled cDNA, 15 µl of 4X Hybridization Buffer ( 20X SDS, 0.4 % SDS), 30 µL formamide. The target mixture is heated for 3 min at 95°C, put on ice for 30 sec and centrifuged to remove dust for 1 min. The target mixture was put on the chip as quickly as possible. The microarray is sealed in a chamber and submerged in a 42°C water bath for approximately 16 h. The microarray is washed for 4 min in 1xSSC, 0.2% SDS (42°C); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC (RT); dipped a few times in distilled water and dried immediately by compressed nitrogen stream.


title: Control_siRNA

source_name: primary hepatocyte, control siRNA

value: Control siRNA


title: HMEC_90% confluent_25µg/mL_of_ENP_rep1

source_name: HMEC, 90 % confluent, 25 µg/mL of ENP, replicate 1


title: plasma from healthy donor [237]

city: GuangZhou

first: jinze

last: zheng

address: Dongfeng east road 651#

country: China

institute: Sun Yat-Sen University Cancer Center

description: MicroRNA expression profiles in plasma

hyb_protocol: The labeling and hybridization procedures were performed according to the protocols in the Agilent microRNA Microarray System.

scan_protocol: The microarray image information was converted into spot intensity values using Feature Extraction Software Rev. 9.5.3 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). The signal after background subtraction was exported directly into the GeneSpring GX10 software (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). .

data_processing:
The raw signals obtained for single-color CY3 hybridization were normalized to the endogenous control mir-454.
A log transformation of base 10 was performed before data analysis

source_name: plasma from healthy donor

label_protocol: Total RNA (100 ng) derived from the plasma samples was labeled with Cy3.

extract_protocol: RNA from 400 μL of plasma was isolated using the mirVana PARIS microRNA Isolation kit according to the manufacturer’s instructions (Ambion, Austin, TX). Total RNA from cells was extracted using Trizol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) according to the manufacturer’s instructions. The RNA concentration was quantified using a NanoDrop 1000 Spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Waltham, MA). 1000 spectrophotometer and quality was monitored with the Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA).

treatment_protocol: For the plasma preparation, peripheral blood (3 ml) was drawn into EDTA tubes. Within 30 min, the tubes were centrifuged at 820 g for 10 min. Then, 1-ml aliquots of the plasma were transferred to 1.5-ml tubes and centrifuged at 16,000 g for another 10 min to remove any remaining cellular debris. Subsequently, the supernatants were transferred to fresh tubes and immediately stored at –80°C.

value: Peripheral Blood

value: male

value: 40 years


title: HMEC_90% confluent_0µg/mL_of_ENP_rep3

description: Gene expression in HMEC at 90 % of confluence after 24 h in absence of ENP exposure (0 µg/mL)

source_name: HMEC, 90 % confluent, 0 µg/mL of ENP, replicate 3

value: control


title: plasma from healthy donor [233]

description: MicroRNA expression profiles in plasma

value: 41 years


title: 14286386 - WT leaves Repet2 vs WT + 5CHO-THF leaves Repet2

description: Folates and 1C metabolism

hyb_protocol: WT + 5CHO-THF leaves Repet2 Cy5 / WT leaves Repet2 Cy3 : 30pmol. (Hybridization_Protocol.txt) Hybridization Protocol: CATMA slides (Corning Microarray Technology, CORNING) are pretreated in the prehybridisation solution (1 % BSA, 0.1 SDS, 5X SSC ) at 42°C for 60 min. They are dipped a couple of times in distilled water at room temperature, then in isopropanol and dried immediately by compressed nitrogen stream. Slides were placed in Corning hybridization chambers with a 25x60 lifterslip and 10ul of distilled water for each groove. The target was diluted to a final volume of 60 µL as follows 15µl of purified, labeled cDNA, 15 µl of 4X Hybridization Buffer ( 20X SDS, 0.4 % SDS), 30 µL formamide. The target mixture is heated for 3 min at 95°C, put on ice for 30 sec and centrifuged to remove dust for 1 min. The target mixture was put on the chip as quickly as possible. The microarray is sealed in a chamber and submerged in a 42°C water bath for approximately 16 h. The microarray is washed for 4 min in 1xSSC, 0.2% SDS (42°C); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC (RT); dipped a few times in distilled water and dried immediately by compressed nitrogen stream.

source_name: WT + 5CHO-THF leaves Repet2

growth_protocol: caulin leaf - Media=Murashige and Skoog medium (pH 5.7) containing 1% (w/v) Suc, phytagar (0.5%–1%), and vitamins pyridoxine-HCl, nicotinic acid (0.5 mg/mL), and thiamine (1 mg/mL). Plates were incubated vertically in a growth room. For 5-Formyl-THF [(6S)-5-formyl-5,6,7,8-tetrahydrofolic acid, calcium salt; natural calciumfolinate; Schircks Laboratories] and Methotrexate [(2S)-2-[(4-{[(2,4-diaminopteridin-6-yl)methyl](methyl)amino}phenyl)formamido]pentanedioic acid; Schircks Laboratories] supplementation, stock solutions were applied to the growth medium to achieve the desired working concentration. hygrometry- Temperature=19ºCNight-22ºCDay Light=120-140 mmol photons m2/s

extract_protocol: WT + 5CHO-THF leaves Repet2:10ug. (Amplification_Ambion.txt) Amplification des ARN messagers (Kit AMBION MessageAmp aRNA Amplification #1750) Le kit se compose de 3 parties : réactifs enzymatiques à -20°C, tampons de purification à 4°C et colonnes à température ambiante. Si les concentrations en ARN sont inférieures à 180 ng/µl, prévoir une précipitation. Transcription inverse A partir d'ARN totaux purifiés et quantifiés au Ribogreen : ARN tot (1µg)+ eau 5.5 µl T7-oligo-dT   0.5 µl Incuber dans le bloc chauffant à 65°C 10min, centrifuger brièvement , puis mettre sur glace. Préparer le Mix (prévoir 5% en plus) en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace :   10X First Strand Buffer :  1µl Ribonuclease Inhibitor :  0.5µl dNTP Mix :    2µl Reverse Transcriptase  0.5µl Ajouter 4 µl de ce mix dans les 6µl d'ARN, agiter légèrement et centrifuger brièvement. Volume final = 10 µl Incuber 2h dans un bain-marie à 42°C Centrifuger brièvement , puis mettre sur glace Allumer le bain-Marie à 16°C dans la chambre froide. Faire un mix dans cet ordre (prévoir 5% en plus) en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace: Eau RNase-Free  31.5µl 10X 2nd Strand Buffer 5µl dNTP Mix    2µl DNA Polymérase  1µl RNase H.     0.5µl Ajouter 40 µl de ce mix aux 10 µl précédents. Volume final = 50 µl. Mélanger par pipetage et centrifuger brièvement. Incuber 2h à 16°C Ajouter 50 µl d'eau DEPC. Possibilité de garder les échantillons après cette étape à -20°C en attendant la purification Purification des cDNA: cette étape doit se faire le plus tard possible Allumer un bain-Marie et le régler à 50 °C. Y mettre l'eau RNase-free à préchauffer. À 4 °C, le Binding Buffer peut avoir cristallisé, il faut bien le redissoudre avant utilisation en le chauffant brièvement au bain marie à 50°C. Equilibrer la colonne: déposer 50 µl de cDNA Binding Buffer sur la colonne cDNA Incuber 5 min à température ambiante. (Ne pas centrifuger) Ajouter 250µl de cDNA Binding Buffer dans les 100µl d'[ADN + eau] Mélanger par pipetage Déposer le tout sur la colonne équilibrée Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube 2 ml Lavage : déposer 500 µl de cDNA Wash Buffer sur la colonne (Vérifier que l'éthanol a bien été ajouté) Centrifuger 1 minute à 10000g à température ambiante Jeter le liquide et centrifuger à nouveau 1 minute à 10 000g afin d'éliminer les traces d'éthanol Transférer colonne dans un tube de 1.5 ml Déposer au milieu de la colonne 5µl d'eau RNase-free à 50°C Incuber 2 minutes à température ambiante et remettre l'eau à 50°C Centrifuger 1,5 minutes à 10000g à température ambiante Répéter l'élution dans le même tube avec 5µl d'eau RNase-free à 50°C et éteindre le bain-marie Transcription in vitro pour la synthèse d'aRNA(prévoir 5% en plus) : Préparer le mix suivant en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace : 2µl ATP Soln (75mM) 2µl CTP Soln (75mM) 2µl GTP Soln (75mM) 2µl UTP Soln (75mM) 2µl T7 10X réaction Buffer Attention : il peut avoir cristallisé : bien le redissoudre avant utilisation 2µl T7 enzyme Mix Mélanger par pipetage, centrifugation brève Ajouter 12 µl de ce mix dans les 8 µl précédents. Volume final = 20 µl Incuber 14h dans l'étuve "bactério" à 37°C. Rajouter 1 µl de DNase I, mélanger par pipetage, centrifugation brève Incuber 30min dans le bloc chauffant à 37°C. Possibilité de conserver à -20°C avant la purification Ajouter 80 µl "Elution Solution" à l'éluat. Vf = 100µl. Purification des aRNA : Allumer un bain-Marie et le régler à 50 °C. Y mettre l'eau RNase-free à préchauffer. Ajouter aux 100 µl précédents :  350µl aRNA Binding Buffer  250µl EtOH 100%. Mélanger par pipetage et déposer l'échantillon sur le centre de la colonne aRNA Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube de 2 ml Lavage : déposer 650µl aRNA Wash Buffer sur la colonne (Vérifier que l'éthanol a bien été ajouté) Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et centrifuger à nouveau 1 minute à 10 000g afin d'éliminer les traces d'éthanol Transférer la colonne dans un tube de 1.5 ml Elution : déposer au milieu de la colonne 50µl d'eau RNase-free à 50°C Incuber 2 minutes à température ambiante et remettre l'eau à 50°C Centrifuger 1,5 minutes à 10 000g à température ambiante Répéter l'élution dans le même tube : Déposer au milieu de la colonne 50µl d'eau RNase-free à 50°C et éteindre le bain-marie Incuber 2 minutes à température ambiante Centrifuger 1,5 minutes à 10 000g à température ambiante Le volume final est entre 90 et 100 µl. Quantification : Préparer une dilution au 1/20 pour chaque échantillon et quantifier au ribogreen. Si la quantité finale est inférieure à 50 µg, vérifier la qualité sur gel (ou puce Bio-Analyser.) Si la concentration est inférieure à 625 ng/µl, prévoir une précipitation pour le marquage : Ajouter 10 µl de Na Acetate 3M, pH 5,2 et 250 µl d'Ethanol 96,2% Précipiter 1 heure à -20°C ou 30 minutes à -80°C Centrifuger 30 minutes 13 000 rpm à 4°C Vider le surnageant et laver le culot avec 500 µl d'éthanol à 70 % Centrifuger 5 minutes à 13 000 rpm à 4°C et pipeter le surnageant Laisser le culot sécher à l'air libre sur glace pendant 15 minutes Resuspendre avec de l'eau RNase-free à une concentration de 1 µg/µl.

value: columbia

value: wild type

value: leaves

source_name: WT leaves Repet2

extract_protocol: WT leaves Repet2:10ug. (Amplification_Ambion.txt) Amplification des ARN messagers (Kit AMBION MessageAmp aRNA Amplification #1750) Le kit se compose de 3 parties : réactifs enzymatiques à -20°C, tampons de purification à 4°C et colonnes à température ambiante. Si les concentrations en ARN sont inférieures à 180 ng/µl, prévoir une précipitation. Transcription inverse A partir d'ARN totaux purifiés et quantifiés au Ribogreen : ARN tot (1µg)+ eau 5.5 µl T7-oligo-dT   0.5 µl Incuber dans le bloc chauffant à 65°C 10min, centrifuger brièvement , puis mettre sur glace. Préparer le Mix (prévoir 5% en plus) en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace :   10X First Strand Buffer :  1µl Ribonuclease Inhibitor :  0.5µl dNTP Mix :    2µl Reverse Transcriptase  0.5µl Ajouter 4 µl de ce mix dans les 6µl d'ARN, agiter légèrement et centrifuger brièvement. Volume final = 10 µl Incuber 2h dans un bain-marie à 42°C Centrifuger brièvement , puis mettre sur glace Allumer le bain-Marie à 16°C dans la chambre froide. Faire un mix dans cet ordre (prévoir 5% en plus) en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace: Eau RNase-Free  31.5µl 10X 2nd Strand Buffer 5µl dNTP Mix    2µl DNA Polymérase  1µl RNase H.     0.5µl Ajouter 40 µl de ce mix aux 10 µl précédents. Volume final = 50 µl. Mélanger par pipetage et centrifuger brièvement. Incuber 2h à 16°C Ajouter 50 µl d'eau DEPC. Possibilité de garder les échantillons après cette étape à -20°C en attendant la purification Purification des cDNA: cette étape doit se faire le plus tard possible Allumer un bain-Marie et le régler à 50 °C. Y mettre l'eau RNase-free à préchauffer. À 4 °C, le Binding Buffer peut avoir cristallisé, il faut bien le redissoudre avant utilisation en le chauffant brièvement au bain marie à 50°C. Equilibrer la colonne: déposer 50 µl de cDNA Binding Buffer sur la colonne cDNA Incuber 5 min à température ambiante. (Ne pas centrifuger) Ajouter 250µl de cDNA Binding Buffer dans les 100µl d'[ADN + eau] Mélanger par pipetage Déposer le tout sur la colonne équilibrée Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube 2 ml Lavage : déposer 500 µl de cDNA Wash Buffer sur la colonne (Vérifier que l'éthanol a bien été ajouté) Centrifuger 1 minute à 10000g à température ambiante Jeter le liquide et centrifuger à nouveau 1 minute à 10 000g afin d'éliminer les traces d'éthanol Transférer colonne dans un tube de 1.5 ml Déposer au milieu de la colonne 5µl d'eau RNase-free à 50°C Incuber 2 minutes à température ambiante et remettre l'eau à 50°C Centrifuger 1,5 minutes à 10000g à température ambiante Répéter l'élution dans le même tube avec 5µl d'eau RNase-free à 50°C et éteindre le bain-marie Transcription in vitro pour la synthèse d'aRNA(prévoir 5% en plus) : Préparer le mix suivant en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace : 2µl ATP Soln (75mM) 2µl CTP Soln (75mM) 2µl GTP Soln (75mM) 2µl UTP Soln (75mM) 2µl T7 10X réaction Buffer Attention : il peut avoir cristallisé : bien le redissoudre avant utilisation 2µl T7 enzyme Mix Mélanger par pipetage, centrifugation brève Ajouter 12 µl de ce mix dans les 8 µl précédents. Volume final = 20 µl Incuber 14h dans l'étuve "bactério" à 37°C. Rajouter 1 µl de DNase I, mélanger par pipetage, centrifugation brève Incuber 30min dans le bloc chauffant à 37°C. Possibilité de conserver à -20°C avant la purification Ajouter 80 µl "Elution Solution" à l'éluat. Vf = 100µl. Purification des aRNA : Allumer un bain-Marie et le régler à 50 °C. Y mettre l'eau RNase-free à préchauffer. Ajouter aux 100 µl précédents :  350µl aRNA Binding Buffer  250µl EtOH 100%. Mélanger par pipetage et déposer l'échantillon sur le centre de la colonne aRNA Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube de 2 ml Lavage : déposer 650µl aRNA Wash Buffer sur la colonne (Vérifier que l'éthanol a bien été ajouté) Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et centrifuger à nouveau 1 minute à 10 000g afin d'éliminer les traces d'éthanol Transférer la colonne dans un tube de 1.5 ml Elution : déposer au milieu de la colonne 50µl d'eau RNase-free à 50°C Incuber 2 minutes à température ambiante et remettre l'eau à 50°C Centrifuger 1,5 minutes à 10 000g à température ambiante Répéter l'élution dans le même tube : Déposer au milieu de la colonne 50µl d'eau RNase-free à 50°C et éteindre le bain-marie Incuber 2 minutes à température ambiante Centrifuger 1,5 minutes à 10 000g à température ambiante Le volume final est entre 90 et 100 µl. Quantification : Préparer une dilution au 1/20 pour chaque échantillon et quantifier au ribogreen. Si la quantité finale est inférieure à 50 µg, vérifier la qualité sur gel (ou puce Bio-Analyser.) Si la concentration est inférieure à 625 ng/µl, prévoir une précipitation pour le marquage : Ajouter 10 µl de Na Acetate 3M, pH 5,2 et 250 µl d'Ethanol 96,2% Précipiter 1 heure à -20°C ou 30 minutes à -80°C Centrifuger 30 minutes 13 000 rpm à 4°C Vider le surnageant et laver le culot avec 500 µl d'éthanol à 70 % Centrifuger 5 minutes à 13 000 rpm à 4°C et pipeter le surnageant Laisser le culot sécher à l'air libre sur glace pendant 15 minutes Resuspendre avec de l'eau RNase-free à une concentration de 1 µg/µl.


title: CRF sham

source_name: liver, sham-operated

growth_protocol: 5/6 nephrectomized mice and sham-operated mice aged 4 to 16 weeks were housed under a 12-h light/dark cycle at room temperature 24 ± 1°C and humidity 60 ± 10% with food and water available ad libitum.

treatment_protocol: 5/6Nxs were generated by the ablation of 2/3 of the right kidney and enucleation of the left kidney 1 week later.

tag: background strain

value: ICR

tag: operation

value: sham-operated

value: liver


title: plasma from healthy donor [197]

description: MicroRNA expression profiles in plasma

value: 43 years


title: 14286385 - WT + 5CHO-THF leaves Repet2 vs WT leaves Repet2

description: Folates and 1C metabolism

hyb_protocol: WT leaves Repet2 Cy5 / WT + 5CHO-THF leaves Repet2 Cy3 : 30pmol. (Hybridization_Protocol.txt) Hybridization Protocol: CATMA slides (Corning Microarray Technology, CORNING) are pretreated in the prehybridisation solution (1 % BSA, 0.1 SDS, 5X SSC ) at 42°C for 60 min. They are dipped a couple of times in distilled water at room temperature, then in isopropanol and dried immediately by compressed nitrogen stream. Slides were placed in Corning hybridization chambers with a 25x60 lifterslip and 10ul of distilled water for each groove. The target was diluted to a final volume of 60 µL as follows 15µl of purified, labeled cDNA, 15 µl of 4X Hybridization Buffer ( 20X SDS, 0.4 % SDS), 30 µL formamide. The target mixture is heated for 3 min at 95°C, put on ice for 30 sec and centrifuged to remove dust for 1 min. The target mixture was put on the chip as quickly as possible. The microarray is sealed in a chamber and submerged in a 42°C water bath for approximately 16 h. The microarray is washed for 4 min in 1xSSC, 0.2% SDS (42°C); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC (RT); dipped a few times in distilled water and dried immediately by compressed nitrogen stream.


title: HMEC_90% confluent_0µg/mL_of_ENP_rep1

source_name: HMEC, 90 % confluent, 0 µg/mL of ENP, replicate 1

value: mammary epithelial cells

value: female

value: HMEC 184


title: 14286384 - WT + 5CHO-THF leaves Repet1 vs WT leaves Repet1

description: Folates and 1C metabolism

hyb_protocol: WT leaves Repet1 Cy5 / WT + 5CHO-THF leaves Repet1 Cy3 : 30pmol. (Hybridization_Protocol.txt) Hybridization Protocol: CATMA slides (Corning Microarray Technology, CORNING) are pretreated in the prehybridisation solution (1 % BSA, 0.1 SDS, 5X SSC ) at 42°C for 60 min. They are dipped a couple of times in distilled water at room temperature, then in isopropanol and dried immediately by compressed nitrogen stream. Slides were placed in Corning hybridization chambers with a 25x60 lifterslip and 10ul of distilled water for each groove. The target was diluted to a final volume of 60 µL as follows 15µl of purified, labeled cDNA, 15 µl of 4X Hybridization Buffer ( 20X SDS, 0.4 % SDS), 30 µL formamide. The target mixture is heated for 3 min at 95°C, put on ice for 30 sec and centrifuged to remove dust for 1 min. The target mixture was put on the chip as quickly as possible. The microarray is sealed in a chamber and submerged in a 42°C water bath for approximately 16 h. The microarray is washed for 4 min in 1xSSC, 0.2% SDS (42°C); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC (RT); dipped a few times in distilled water and dried immediately by compressed nitrogen stream.

source_name: WT leaves Repet1

extract_protocol: WT leaves Repet1:10ug. (Amplification_Ambion.txt) Amplification des ARN messagers (Kit AMBION MessageAmp aRNA Amplification #1750) Le kit se compose de 3 parties : réactifs enzymatiques à -20°C, tampons de purification à 4°C et colonnes à température ambiante. Si les concentrations en ARN sont inférieures à 180 ng/µl, prévoir une précipitation. Transcription inverse A partir d'ARN totaux purifiés et quantifiés au Ribogreen : ARN tot (1µg)+ eau 5.5 µl T7-oligo-dT   0.5 µl Incuber dans le bloc chauffant à 65°C 10min, centrifuger brièvement , puis mettre sur glace. Préparer le Mix (prévoir 5% en plus) en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace :   10X First Strand Buffer :  1µl Ribonuclease Inhibitor :  0.5µl dNTP Mix :    2µl Reverse Transcriptase  0.5µl Ajouter 4 µl de ce mix dans les 6µl d'ARN, agiter légèrement et centrifuger brièvement. Volume final = 10 µl Incuber 2h dans un bain-marie à 42°C Centrifuger brièvement , puis mettre sur glace Allumer le bain-Marie à 16°C dans la chambre froide. Faire un mix dans cet ordre (prévoir 5% en plus) en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace: Eau RNase-Free  31.5µl 10X 2nd Strand Buffer 5µl dNTP Mix    2µl DNA Polymérase  1µl RNase H.     0.5µl Ajouter 40 µl de ce mix aux 10 µl précédents. Volume final = 50 µl. Mélanger par pipetage et centrifuger brièvement. Incuber 2h à 16°C Ajouter 50 µl d'eau DEPC. Possibilité de garder les échantillons après cette étape à -20°C en attendant la purification Purification des cDNA: cette étape doit se faire le plus tard possible Allumer un bain-Marie et le régler à 50 °C. Y mettre l'eau RNase-free à préchauffer. À 4 °C, le Binding Buffer peut avoir cristallisé, il faut bien le redissoudre avant utilisation en le chauffant brièvement au bain marie à 50°C. Equilibrer la colonne: déposer 50 µl de cDNA Binding Buffer sur la colonne cDNA Incuber 5 min à température ambiante. (Ne pas centrifuger) Ajouter 250µl de cDNA Binding Buffer dans les 100µl d'[ADN + eau] Mélanger par pipetage Déposer le tout sur la colonne équilibrée Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube 2 ml Lavage : déposer 500 µl de cDNA Wash Buffer sur la colonne (Vérifier que l'éthanol a bien été ajouté) Centrifuger 1 minute à 10000g à température ambiante Jeter le liquide et centrifuger à nouveau 1 minute à 10 000g afin d'éliminer les traces d'éthanol Transférer colonne dans un tube de 1.5 ml Déposer au milieu de la colonne 5µl d'eau RNase-free à 50°C Incuber 2 minutes à température ambiante et remettre l'eau à 50°C Centrifuger 1,5 minutes à 10000g à température ambiante Répéter l'élution dans le même tube avec 5µl d'eau RNase-free à 50°C et éteindre le bain-marie Transcription in vitro pour la synthèse d'aRNA(prévoir 5% en plus) : Préparer le mix suivant en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace : 2µl ATP Soln (75mM) 2µl CTP Soln (75mM) 2µl GTP Soln (75mM) 2µl UTP Soln (75mM) 2µl T7 10X réaction Buffer Attention : il peut avoir cristallisé : bien le redissoudre avant utilisation 2µl T7 enzyme Mix Mélanger par pipetage, centrifugation brève Ajouter 12 µl de ce mix dans les 8 µl précédents. Volume final = 20 µl Incuber 14h dans l'étuve "bactério" à 37°C. Rajouter 1 µl de DNase I, mélanger par pipetage, centrifugation brève Incuber 30min dans le bloc chauffant à 37°C. Possibilité de conserver à -20°C avant la purification Ajouter 80 µl "Elution Solution" à l'éluat. Vf = 100µl. Purification des aRNA : Allumer un bain-Marie et le régler à 50 °C. Y mettre l'eau RNase-free à préchauffer. Ajouter aux 100 µl précédents :  350µl aRNA Binding Buffer  250µl EtOH 100%. Mélanger par pipetage et déposer l'échantillon sur le centre de la colonne aRNA Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube de 2 ml Lavage : déposer 650µl aRNA Wash Buffer sur la colonne (Vérifier que l'éthanol a bien été ajouté) Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et centrifuger à nouveau 1 minute à 10 000g afin d'éliminer les traces d'éthanol Transférer la colonne dans un tube de 1.5 ml Elution : déposer au milieu de la colonne 50µl d'eau RNase-free à 50°C Incuber 2 minutes à température ambiante et remettre l'eau à 50°C Centrifuger 1,5 minutes à 10 000g à température ambiante Répéter l'élution dans le même tube : Déposer au milieu de la colonne 50µl d'eau RNase-free à 50°C et éteindre le bain-marie Incuber 2 minutes à température ambiante Centrifuger 1,5 minutes à 10 000g à température ambiante Le volume final est entre 90 et 100 µl. Quantification : Préparer une dilution au 1/20 pour chaque échantillon et quantifier au ribogreen. Si la quantité finale est inférieure à 50 µg, vérifier la qualité sur gel (ou puce Bio-Analyser.) Si la concentration est inférieure à 625 ng/µl, prévoir une précipitation pour le marquage : Ajouter 10 µl de Na Acetate 3M, pH 5,2 et 250 µl d'Ethanol 96,2% Précipiter 1 heure à -20°C ou 30 minutes à -80°C Centrifuger 30 minutes 13 000 rpm à 4°C Vider le surnageant et laver le culot avec 500 µl d'éthanol à 70 % Centrifuger 5 minutes à 13 000 rpm à 4°C et pipeter le surnageant Laisser le culot sécher à l'air libre sur glace pendant 15 minutes Resuspendre avec de l'eau RNase-free à une concentration de 1 µg/µl.

source_name: WT + 5CHO-THF leaves Repet1

extract_protocol: WT + 5CHO-THF leaves Repet1:10ug. (Amplification_Ambion.txt) Amplification des ARN messagers (Kit AMBION MessageAmp aRNA Amplification #1750) Le kit se compose de 3 parties : réactifs enzymatiques à -20°C, tampons de purification à 4°C et colonnes à température ambiante. Si les concentrations en ARN sont inférieures à 180 ng/µl, prévoir une précipitation. Transcription inverse A partir d'ARN totaux purifiés et quantifiés au Ribogreen : ARN tot (1µg)+ eau 5.5 µl T7-oligo-dT   0.5 µl Incuber dans le bloc chauffant à 65°C 10min, centrifuger brièvement , puis mettre sur glace. Préparer le Mix (prévoir 5% en plus) en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace :   10X First Strand Buffer :  1µl Ribonuclease Inhibitor :  0.5µl dNTP Mix :    2µl Reverse Transcriptase  0.5µl Ajouter 4 µl de ce mix dans les 6µl d'ARN, agiter légèrement et centrifuger brièvement. Volume final = 10 µl Incuber 2h dans un bain-marie à 42°C Centrifuger brièvement , puis mettre sur glace Allumer le bain-Marie à 16°C dans la chambre froide. Faire un mix dans cet ordre (prévoir 5% en plus) en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace: Eau RNase-Free  31.5µl 10X 2nd Strand Buffer 5µl dNTP Mix    2µl DNA Polymérase  1µl RNase H.     0.5µl Ajouter 40 µl de ce mix aux 10 µl précédents. Volume final = 50 µl. Mélanger par pipetage et centrifuger brièvement. Incuber 2h à 16°C Ajouter 50 µl d'eau DEPC. Possibilité de garder les échantillons après cette étape à -20°C en attendant la purification Purification des cDNA: cette étape doit se faire le plus tard possible Allumer un bain-Marie et le régler à 50 °C. Y mettre l'eau RNase-free à préchauffer. À 4 °C, le Binding Buffer peut avoir cristallisé, il faut bien le redissoudre avant utilisation en le chauffant brièvement au bain marie à 50°C. Equilibrer la colonne: déposer 50 µl de cDNA Binding Buffer sur la colonne cDNA Incuber 5 min à température ambiante. (Ne pas centrifuger) Ajouter 250µl de cDNA Binding Buffer dans les 100µl d'[ADN + eau] Mélanger par pipetage Déposer le tout sur la colonne équilibrée Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube 2 ml Lavage : déposer 500 µl de cDNA Wash Buffer sur la colonne (Vérifier que l'éthanol a bien été ajouté) Centrifuger 1 minute à 10000g à température ambiante Jeter le liquide et centrifuger à nouveau 1 minute à 10 000g afin d'éliminer les traces d'éthanol Transférer colonne dans un tube de 1.5 ml Déposer au milieu de la colonne 5µl d'eau RNase-free à 50°C Incuber 2 minutes à température ambiante et remettre l'eau à 50°C Centrifuger 1,5 minutes à 10000g à température ambiante Répéter l'élution dans le même tube avec 5µl d'eau RNase-free à 50°C et éteindre le bain-marie Transcription in vitro pour la synthèse d'aRNA(prévoir 5% en plus) : Préparer le mix suivant en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace : 2µl ATP Soln (75mM) 2µl CTP Soln (75mM) 2µl GTP Soln (75mM) 2µl UTP Soln (75mM) 2µl T7 10X réaction Buffer Attention : il peut avoir cristallisé : bien le redissoudre avant utilisation 2µl T7 enzyme Mix Mélanger par pipetage, centrifugation brève Ajouter 12 µl de ce mix dans les 8 µl précédents. Volume final = 20 µl Incuber 14h dans l'étuve "bactério" à 37°C. Rajouter 1 µl de DNase I, mélanger par pipetage, centrifugation brève Incuber 30min dans le bloc chauffant à 37°C. Possibilité de conserver à -20°C avant la purification Ajouter 80 µl "Elution Solution" à l'éluat. Vf = 100µl. Purification des aRNA : Allumer un bain-Marie et le régler à 50 °C. Y mettre l'eau RNase-free à préchauffer. Ajouter aux 100 µl précédents :  350µl aRNA Binding Buffer  250µl EtOH 100%. Mélanger par pipetage et déposer l'échantillon sur le centre de la colonne aRNA Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube de 2 ml Lavage : déposer 650µl aRNA Wash Buffer sur la colonne (Vérifier que l'éthanol a bien été ajouté) Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et centrifuger à nouveau 1 minute à 10 000g afin d'éliminer les traces d'éthanol Transférer la colonne dans un tube de 1.5 ml Elution : déposer au milieu de la colonne 50µl d'eau RNase-free à 50°C Incuber 2 minutes à température ambiante et remettre l'eau à 50°C Centrifuger 1,5 minutes à 10 000g à température ambiante Répéter l'élution dans le même tube : Déposer au milieu de la colonne 50µl d'eau RNase-free à 50°C et éteindre le bain-marie Incuber 2 minutes à température ambiante Centrifuger 1,5 minutes à 10 000g à température ambiante Le volume final est entre 90 et 100 µl. Quantification : Préparer une dilution au 1/20 pour chaque échantillon et quantifier au ribogreen. Si la quantité finale est inférieure à 50 µg, vérifier la qualité sur gel (ou puce Bio-Analyser.) Si la concentration est inférieure à 625 ng/µl, prévoir une précipitation pour le marquage : Ajouter 10 µl de Na Acetate 3M, pH 5,2 et 250 µl d'Ethanol 96,2% Précipiter 1 heure à -20°C ou 30 minutes à -80°C Centrifuger 30 minutes 13 000 rpm à 4°C Vider le surnageant et laver le culot avec 500 µl d'éthanol à 70 % Centrifuger 5 minutes à 13 000 rpm à 4°C et pipeter le surnageant Laisser le culot sécher à l'air libre sur glace pendant 15 minutes Resuspendre avec de l'eau RNase-free à une concentration de 1 µg/µl.


title: HMEC_90% confluent_25µg/mL_of_ENP_rep2

source_name: HMEC, 90 % confluent, 25 µg/mL of ENP, replicate 2

value: 25 ug/ml Eudragit RS nanoparticles


title: plasma from healthy donor [176]

description: MicroRNA expression profiles in plasma


title: Ope brain

source_name: brain, nephrectomized

value: nephrectomized

value: brain


title: 14286383 - WT leaves Repet1 vs WT + 5CHO-THF leaves Repet1

description: Folates and 1C metabolism

hyb_protocol: WT + 5CHO-THF leaves Repet1 Cy5 / WT leaves Repet1 Cy3 : 30pmol. (Hybridization_Protocol.txt) Hybridization Protocol: CATMA slides (Corning Microarray Technology, CORNING) are pretreated in the prehybridisation solution (1 % BSA, 0.1 SDS, 5X SSC ) at 42°C for 60 min. They are dipped a couple of times in distilled water at room temperature, then in isopropanol and dried immediately by compressed nitrogen stream. Slides were placed in Corning hybridization chambers with a 25x60 lifterslip and 10ul of distilled water for each groove. The target was diluted to a final volume of 60 µL as follows 15µl of purified, labeled cDNA, 15 µl of 4X Hybridization Buffer ( 20X SDS, 0.4 % SDS), 30 µL formamide. The target mixture is heated for 3 min at 95°C, put on ice for 30 sec and centrifuged to remove dust for 1 min. The target mixture was put on the chip as quickly as possible. The microarray is sealed in a chamber and submerged in a 42°C water bath for approximately 16 h. The microarray is washed for 4 min in 1xSSC, 0.2% SDS (42°C); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC (RT); dipped a few times in distilled water and dried immediately by compressed nitrogen stream.


title: plasma from healthy donor [173]

description: MicroRNA expression profiles in plasma

value: Peripheral Blood

value: male


title: 14286382 - WT + 5CHO-THF roots Repet3 vs WT roots Repet3

description: Folates and 1C metabolism

hyb_protocol: WT roots Repet3 Cy5 / WT + 5CHO-THF roots Repet3 Cy3 : 30pmol. (Hybridization_Protocol.txt) Hybridization Protocol: CATMA slides (Corning Microarray Technology, CORNING) are pretreated in the prehybridisation solution (1 % BSA, 0.1 SDS, 5X SSC ) at 42°C for 60 min. They are dipped a couple of times in distilled water at room temperature, then in isopropanol and dried immediately by compressed nitrogen stream. Slides were placed in Corning hybridization chambers with a 25x60 lifterslip and 10ul of distilled water for each groove. The target was diluted to a final volume of 60 µL as follows 15µl of purified, labeled cDNA, 15 µl of 4X Hybridization Buffer ( 20X SDS, 0.4 % SDS), 30 µL formamide. The target mixture is heated for 3 min at 95°C, put on ice for 30 sec and centrifuged to remove dust for 1 min. The target mixture was put on the chip as quickly as possible. The microarray is sealed in a chamber and submerged in a 42°C water bath for approximately 16 h. The microarray is washed for 4 min in 1xSSC, 0.2% SDS (42°C); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC (RT); dipped a few times in distilled water and dried immediately by compressed nitrogen stream.

source_name: WT roots Repet3

extract_protocol: WT roots Repet3:10ug. (Amplification_Ambion.txt) Amplification des ARN messagers (Kit AMBION MessageAmp aRNA Amplification #1750) Le kit se compose de 3 parties : réactifs enzymatiques à -20°C, tampons de purification à 4°C et colonnes à température ambiante. Si les concentrations en ARN sont inférieures à 180 ng/µl, prévoir une précipitation. Transcription inverse A partir d'ARN totaux purifiés et quantifiés au Ribogreen : ARN tot (1µg)+ eau 5.5 µl T7-oligo-dT   0.5 µl Incuber dans le bloc chauffant à 65°C 10min, centrifuger brièvement , puis mettre sur glace. Préparer le Mix (prévoir 5% en plus) en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace :   10X First Strand Buffer :  1µl Ribonuclease Inhibitor :  0.5µl dNTP Mix :    2µl Reverse Transcriptase  0.5µl Ajouter 4 µl de ce mix dans les 6µl d'ARN, agiter légèrement et centrifuger brièvement. Volume final = 10 µl Incuber 2h dans un bain-marie à 42°C Centrifuger brièvement , puis mettre sur glace Allumer le bain-Marie à 16°C dans la chambre froide. Faire un mix dans cet ordre (prévoir 5% en plus) en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace: Eau RNase-Free  31.5µl 10X 2nd Strand Buffer 5µl dNTP Mix    2µl DNA Polymérase  1µl RNase H.     0.5µl Ajouter 40 µl de ce mix aux 10 µl précédents. Volume final = 50 µl. Mélanger par pipetage et centrifuger brièvement. Incuber 2h à 16°C Ajouter 50 µl d'eau DEPC. Possibilité de garder les échantillons après cette étape à -20°C en attendant la purification Purification des cDNA: cette étape doit se faire le plus tard possible Allumer un bain-Marie et le régler à 50 °C. Y mettre l'eau RNase-free à préchauffer. À 4 °C, le Binding Buffer peut avoir cristallisé, il faut bien le redissoudre avant utilisation en le chauffant brièvement au bain marie à 50°C. Equilibrer la colonne: déposer 50 µl de cDNA Binding Buffer sur la colonne cDNA Incuber 5 min à température ambiante. (Ne pas centrifuger) Ajouter 250µl de cDNA Binding Buffer dans les 100µl d'[ADN + eau] Mélanger par pipetage Déposer le tout sur la colonne équilibrée Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube 2 ml Lavage : déposer 500 µl de cDNA Wash Buffer sur la colonne (Vérifier que l'éthanol a bien été ajouté) Centrifuger 1 minute à 10000g à température ambiante Jeter le liquide et centrifuger à nouveau 1 minute à 10 000g afin d'éliminer les traces d'éthanol Transférer colonne dans un tube de 1.5 ml Déposer au milieu de la colonne 5µl d'eau RNase-free à 50°C Incuber 2 minutes à température ambiante et remettre l'eau à 50°C Centrifuger 1,5 minutes à 10000g à température ambiante Répéter l'élution dans le même tube avec 5µl d'eau RNase-free à 50°C et éteindre le bain-marie Transcription in vitro pour la synthèse d'aRNA(prévoir 5% en plus) : Préparer le mix suivant en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace : 2µl ATP Soln (75mM) 2µl CTP Soln (75mM) 2µl GTP Soln (75mM) 2µl UTP Soln (75mM) 2µl T7 10X réaction Buffer Attention : il peut avoir cristallisé : bien le redissoudre avant utilisation 2µl T7 enzyme Mix Mélanger par pipetage, centrifugation brève Ajouter 12 µl de ce mix dans les 8 µl précédents. Volume final = 20 µl Incuber 14h dans l'étuve "bactério" à 37°C. Rajouter 1 µl de DNase I, mélanger par pipetage, centrifugation brève Incuber 30min dans le bloc chauffant à 37°C. Possibilité de conserver à -20°C avant la purification Ajouter 80 µl "Elution Solution" à l'éluat. Vf = 100µl. Purification des aRNA : Allumer un bain-Marie et le régler à 50 °C. Y mettre l'eau RNase-free à préchauffer. Ajouter aux 100 µl précédents :  350µl aRNA Binding Buffer  250µl EtOH 100%. Mélanger par pipetage et déposer l'échantillon sur le centre de la colonne aRNA Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube de 2 ml Lavage : déposer 650µl aRNA Wash Buffer sur la colonne (Vérifier que l'éthanol a bien été ajouté) Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et centrifuger à nouveau 1 minute à 10 000g afin d'éliminer les traces d'éthanol Transférer la colonne dans un tube de 1.5 ml Elution : déposer au milieu de la colonne 50µl d'eau RNase-free à 50°C Incuber 2 minutes à température ambiante et remettre l'eau à 50°C Centrifuger 1,5 minutes à 10 000g à température ambiante Répéter l'élution dans le même tube : Déposer au milieu de la colonne 50µl d'eau RNase-free à 50°C et éteindre le bain-marie Incuber 2 minutes à température ambiante Centrifuger 1,5 minutes à 10 000g à température ambiante Le volume final est entre 90 et 100 µl. Quantification : Préparer une dilution au 1/20 pour chaque échantillon et quantifier au ribogreen. Si la quantité finale est inférieure à 50 µg, vérifier la qualité sur gel (ou puce Bio-Analyser.) Si la concentration est inférieure à 625 ng/µl, prévoir une précipitation pour le marquage : Ajouter 10 µl de Na Acetate 3M, pH 5,2 et 250 µl d'Ethanol 96,2% Précipiter 1 heure à -20°C ou 30 minutes à -80°C Centrifuger 30 minutes 13 000 rpm à 4°C Vider le surnageant et laver le culot avec 500 µl d'éthanol à 70 % Centrifuger 5 minutes à 13 000 rpm à 4°C et pipeter le surnageant Laisser le culot sécher à l'air libre sur glace pendant 15 minutes Resuspendre avec de l'eau RNase-free à une concentration de 1 µg/µl.

value: roots

source_name: WT + 5CHO-THF roots Repet3

extract_protocol: WT + 5CHO-THF roots Repet3:10ug. (Amplification_Ambion.txt) Amplification des ARN messagers (Kit AMBION MessageAmp aRNA Amplification #1750) Le kit se compose de 3 parties : réactifs enzymatiques à -20°C, tampons de purification à 4°C et colonnes à température ambiante. Si les concentrations en ARN sont inférieures à 180 ng/µl, prévoir une précipitation. Transcription inverse A partir d'ARN totaux purifiés et quantifiés au Ribogreen : ARN tot (1µg)+ eau 5.5 µl T7-oligo-dT   0.5 µl Incuber dans le bloc chauffant à 65°C 10min, centrifuger brièvement , puis mettre sur glace. Préparer le Mix (prévoir 5% en plus) en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace :   10X First Strand Buffer :  1µl Ribonuclease Inhibitor :  0.5µl dNTP Mix :    2µl Reverse Transcriptase  0.5µl Ajouter 4 µl de ce mix dans les 6µl d'ARN, agiter légèrement et centrifuger brièvement. Volume final = 10 µl Incuber 2h dans un bain-marie à 42°C Centrifuger brièvement , puis mettre sur glace Allumer le bain-Marie à 16°C dans la chambre froide. Faire un mix dans cet ordre (prévoir 5% en plus) en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace: Eau RNase-Free  31.5µl 10X 2nd Strand Buffer 5µl dNTP Mix    2µl DNA Polymérase  1µl RNase H.     0.5µl Ajouter 40 µl de ce mix aux 10 µl précédents. Volume final = 50 µl. Mélanger par pipetage et centrifuger brièvement. Incuber 2h à 16°C Ajouter 50 µl d'eau DEPC. Possibilité de garder les échantillons après cette étape à -20°C en attendant la purification Purification des cDNA: cette étape doit se faire le plus tard possible Allumer un bain-Marie et le régler à 50 °C. Y mettre l'eau RNase-free à préchauffer. À 4 °C, le Binding Buffer peut avoir cristallisé, il faut bien le redissoudre avant utilisation en le chauffant brièvement au bain marie à 50°C. Equilibrer la colonne: déposer 50 µl de cDNA Binding Buffer sur la colonne cDNA Incuber 5 min à température ambiante. (Ne pas centrifuger) Ajouter 250µl de cDNA Binding Buffer dans les 100µl d'[ADN + eau] Mélanger par pipetage Déposer le tout sur la colonne équilibrée Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube 2 ml Lavage : déposer 500 µl de cDNA Wash Buffer sur la colonne (Vérifier que l'éthanol a bien été ajouté) Centrifuger 1 minute à 10000g à température ambiante Jeter le liquide et centrifuger à nouveau 1 minute à 10 000g afin d'éliminer les traces d'éthanol Transférer colonne dans un tube de 1.5 ml Déposer au milieu de la colonne 5µl d'eau RNase-free à 50°C Incuber 2 minutes à température ambiante et remettre l'eau à 50°C Centrifuger 1,5 minutes à 10000g à température ambiante Répéter l'élution dans le même tube avec 5µl d'eau RNase-free à 50°C et éteindre le bain-marie Transcription in vitro pour la synthèse d'aRNA(prévoir 5% en plus) : Préparer le mix suivant en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace : 2µl ATP Soln (75mM) 2µl CTP Soln (75mM) 2µl GTP Soln (75mM) 2µl UTP Soln (75mM) 2µl T7 10X réaction Buffer Attention : il peut avoir cristallisé : bien le redissoudre avant utilisation 2µl T7 enzyme Mix Mélanger par pipetage, centrifugation brève Ajouter 12 µl de ce mix dans les 8 µl précédents. Volume final = 20 µl Incuber 14h dans l'étuve "bactério" à 37°C. Rajouter 1 µl de DNase I, mélanger par pipetage, centrifugation brève Incuber 30min dans le bloc chauffant à 37°C. Possibilité de conserver à -20°C avant la purification Ajouter 80 µl "Elution Solution" à l'éluat. Vf = 100µl. Purification des aRNA : Allumer un bain-Marie et le régler à 50 °C. Y mettre l'eau RNase-free à préchauffer. Ajouter aux 100 µl précédents :  350µl aRNA Binding Buffer  250µl EtOH 100%. Mélanger par pipetage et déposer l'échantillon sur le centre de la colonne aRNA Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube de 2 ml Lavage : déposer 650µl aRNA Wash Buffer sur la colonne (Vérifier que l'éthanol a bien été ajouté) Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et centrifuger à nouveau 1 minute à 10 000g afin d'éliminer les traces d'éthanol Transférer la colonne dans un tube de 1.5 ml Elution : déposer au milieu de la colonne 50µl d'eau RNase-free à 50°C Incuber 2 minutes à température ambiante et remettre l'eau à 50°C Centrifuger 1,5 minutes à 10 000g à température ambiante Répéter l'élution dans le même tube : Déposer au milieu de la colonne 50µl d'eau RNase-free à 50°C et éteindre le bain-marie Incuber 2 minutes à température ambiante Centrifuger 1,5 minutes à 10 000g à température ambiante Le volume final est entre 90 et 100 µl. Quantification : Préparer une dilution au 1/20 pour chaque échantillon et quantifier au ribogreen. Si la quantité finale est inférieure à 50 µg, vérifier la qualité sur gel (ou puce Bio-Analyser.) Si la concentration est inférieure à 625 ng/µl, prévoir une précipitation pour le marquage : Ajouter 10 µl de Na Acetate 3M, pH 5,2 et 250 µl d'Ethanol 96,2% Précipiter 1 heure à -20°C ou 30 minutes à -80°C Centrifuger 30 minutes 13 000 rpm à 4°C Vider le surnageant et laver le culot avec 500 µl d'éthanol à 70 % Centrifuger 5 minutes à 13 000 rpm à 4°C et pipeter le surnageant Laisser le culot sécher à l'air libre sur glace pendant 15 minutes Resuspendre avec de l'eau RNase-free à une concentration de 1 µg/µl.


title: Sham brain

source_name: brain, sham-operated


title: HMEC_90% confluent_0µg/mL_of_ENP_rep2

source_name: HMEC, 90 % confluent, 0 µg/mL of ENP, replicate 2

value: control


title: HMEC_50% confluent_25µg/mL_of_ENP_rep3

description: Gene expression in HMEC at 50 % of confluence after 24 h in presence of ENP exposure (25 µg/mL)

source_name: HMEC, 50 % confluent, 25 µg/mL of ENP, replicate 3

treatment_protocol: HMEC 184 cells (50% confluence) were incubated with polymeric Eudragit RS nanoparticles (ENP; 25 µg/mL) for 24h, and without incubation (control) in a T.C. incubator at 37°C and 5% CO2.


title: plasma from nasopharyngeal carcinoma patient [76B]

description: MicroRNA expression profiles in plasma

value: 45 years


title: plasma from nasopharyngeal carcinoma patient [72A]

description: MicroRNA expression profiles in plasma

value: 34 years


title: CRF OPE

source_name: liver, nephrectomized


title: plasma from nasopharyngeal carcinoma patient [71A]

description: MicroRNA expression profiles in plasma

value: 32 years


title: plasma from healthy donor [238]

description: MicroRNA expression profiles in plasma

value: 41 years


title: 14286381 - WT roots Repet3 vs WT + 5CHO-THF roots Repet3

description: Folates and 1C metabolism

hyb_protocol: WT + 5CHO-THF roots Repet3 Cy5 / WT roots Repet3 Cy3 : 30pmol. (Hybridization_Protocol.txt) Hybridization Protocol: CATMA slides (Corning Microarray Technology, CORNING) are pretreated in the prehybridisation solution (1 % BSA, 0.1 SDS, 5X SSC ) at 42°C for 60 min. They are dipped a couple of times in distilled water at room temperature, then in isopropanol and dried immediately by compressed nitrogen stream. Slides were placed in Corning hybridization chambers with a 25x60 lifterslip and 10ul of distilled water for each groove. The target was diluted to a final volume of 60 µL as follows 15µl of purified, labeled cDNA, 15 µl of 4X Hybridization Buffer ( 20X SDS, 0.4 % SDS), 30 µL formamide. The target mixture is heated for 3 min at 95°C, put on ice for 30 sec and centrifuged to remove dust for 1 min. The target mixture was put on the chip as quickly as possible. The microarray is sealed in a chamber and submerged in a 42°C water bath for approximately 16 h. The microarray is washed for 4 min in 1xSSC, 0.2% SDS (42°C); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC (RT); dipped a few times in distilled water and dried immediately by compressed nitrogen stream.

value: columbia

value: wild type


title: 14286379 - WT roots Repet2 vs WT + 5CHO-THF roots Repet2

description: Folates and 1C metabolism

hyb_protocol: WT + 5CHO-THF roots Repet2 Cy5 / WT roots Repet2 Cy3 : 30pmol. (Hybridization_Protocol.txt) Hybridization Protocol: CATMA slides (Corning Microarray Technology, CORNING) are pretreated in the prehybridisation solution (1 % BSA, 0.1 SDS, 5X SSC ) at 42°C for 60 min. They are dipped a couple of times in distilled water at room temperature, then in isopropanol and dried immediately by compressed nitrogen stream. Slides were placed in Corning hybridization chambers with a 25x60 lifterslip and 10ul of distilled water for each groove. The target was diluted to a final volume of 60 µL as follows 15µl of purified, labeled cDNA, 15 µl of 4X Hybridization Buffer ( 20X SDS, 0.4 % SDS), 30 µL formamide. The target mixture is heated for 3 min at 95°C, put on ice for 30 sec and centrifuged to remove dust for 1 min. The target mixture was put on the chip as quickly as possible. The microarray is sealed in a chamber and submerged in a 42°C water bath for approximately 16 h. The microarray is washed for 4 min in 1xSSC, 0.2% SDS (42°C); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC (RT); dipped a few times in distilled water and dried immediately by compressed nitrogen stream.

source_name: WT + 5CHO-THF roots Repet2

extract_protocol: WT + 5CHO-THF roots Repet2:10ug. (Amplification_Ambion.txt) Amplification des ARN messagers (Kit AMBION MessageAmp aRNA Amplification #1750) Le kit se compose de 3 parties : réactifs enzymatiques à -20°C, tampons de purification à 4°C et colonnes à température ambiante. Si les concentrations en ARN sont inférieures à 180 ng/µl, prévoir une précipitation. Transcription inverse A partir d'ARN totaux purifiés et quantifiés au Ribogreen : ARN tot (1µg)+ eau 5.5 µl T7-oligo-dT   0.5 µl Incuber dans le bloc chauffant à 65°C 10min, centrifuger brièvement , puis mettre sur glace. Préparer le Mix (prévoir 5% en plus) en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace :   10X First Strand Buffer :  1µl Ribonuclease Inhibitor :  0.5µl dNTP Mix :    2µl Reverse Transcriptase  0.5µl Ajouter 4 µl de ce mix dans les 6µl d'ARN, agiter légèrement et centrifuger brièvement. Volume final = 10 µl Incuber 2h dans un bain-marie à 42°C Centrifuger brièvement , puis mettre sur glace Allumer le bain-Marie à 16°C dans la chambre froide. Faire un mix dans cet ordre (prévoir 5% en plus) en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace: Eau RNase-Free  31.5µl 10X 2nd Strand Buffer 5µl dNTP Mix    2µl DNA Polymérase  1µl RNase H.     0.5µl Ajouter 40 µl de ce mix aux 10 µl précédents. Volume final = 50 µl. Mélanger par pipetage et centrifuger brièvement. Incuber 2h à 16°C Ajouter 50 µl d'eau DEPC. Possibilité de garder les échantillons après cette étape à -20°C en attendant la purification Purification des cDNA: cette étape doit se faire le plus tard possible Allumer un bain-Marie et le régler à 50 °C. Y mettre l'eau RNase-free à préchauffer. À 4 °C, le Binding Buffer peut avoir cristallisé, il faut bien le redissoudre avant utilisation en le chauffant brièvement au bain marie à 50°C. Equilibrer la colonne: déposer 50 µl de cDNA Binding Buffer sur la colonne cDNA Incuber 5 min à température ambiante. (Ne pas centrifuger) Ajouter 250µl de cDNA Binding Buffer dans les 100µl d'[ADN + eau] Mélanger par pipetage Déposer le tout sur la colonne équilibrée Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube 2 ml Lavage : déposer 500 µl de cDNA Wash Buffer sur la colonne (Vérifier que l'éthanol a bien été ajouté) Centrifuger 1 minute à 10000g à température ambiante Jeter le liquide et centrifuger à nouveau 1 minute à 10 000g afin d'éliminer les traces d'éthanol Transférer colonne dans un tube de 1.5 ml Déposer au milieu de la colonne 5µl d'eau RNase-free à 50°C Incuber 2 minutes à température ambiante et remettre l'eau à 50°C Centrifuger 1,5 minutes à 10000g à température ambiante Répéter l'élution dans le même tube avec 5µl d'eau RNase-free à 50°C et éteindre le bain-marie Transcription in vitro pour la synthèse d'aRNA(prévoir 5% en plus) : Préparer le mix suivant en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace : 2µl ATP Soln (75mM) 2µl CTP Soln (75mM) 2µl GTP Soln (75mM) 2µl UTP Soln (75mM) 2µl T7 10X réaction Buffer Attention : il peut avoir cristallisé : bien le redissoudre avant utilisation 2µl T7 enzyme Mix Mélanger par pipetage, centrifugation brève Ajouter 12 µl de ce mix dans les 8 µl précédents. Volume final = 20 µl Incuber 14h dans l'étuve "bactério" à 37°C. Rajouter 1 µl de DNase I, mélanger par pipetage, centrifugation brève Incuber 30min dans le bloc chauffant à 37°C. Possibilité de conserver à -20°C avant la purification Ajouter 80 µl "Elution Solution" à l'éluat. Vf = 100µl. Purification des aRNA : Allumer un bain-Marie et le régler à 50 °C. Y mettre l'eau RNase-free à préchauffer. Ajouter aux 100 µl précédents :  350µl aRNA Binding Buffer  250µl EtOH 100%. Mélanger par pipetage et déposer l'échantillon sur le centre de la colonne aRNA Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube de 2 ml Lavage : déposer 650µl aRNA Wash Buffer sur la colonne (Vérifier que l'éthanol a bien été ajouté) Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et centrifuger à nouveau 1 minute à 10 000g afin d'éliminer les traces d'éthanol Transférer la colonne dans un tube de 1.5 ml Elution : déposer au milieu de la colonne 50µl d'eau RNase-free à 50°C Incuber 2 minutes à température ambiante et remettre l'eau à 50°C Centrifuger 1,5 minutes à 10 000g à température ambiante Répéter l'élution dans le même tube : Déposer au milieu de la colonne 50µl d'eau RNase-free à 50°C et éteindre le bain-marie Incuber 2 minutes à température ambiante Centrifuger 1,5 minutes à 10 000g à température ambiante Le volume final est entre 90 et 100 µl. Quantification : Préparer une dilution au 1/20 pour chaque échantillon et quantifier au ribogreen. Si la quantité finale est inférieure à 50 µg, vérifier la qualité sur gel (ou puce Bio-Analyser.) Si la concentration est inférieure à 625 ng/µl, prévoir une précipitation pour le marquage : Ajouter 10 µl de Na Acetate 3M, pH 5,2 et 250 µl d'Ethanol 96,2% Précipiter 1 heure à -20°C ou 30 minutes à -80°C Centrifuger 30 minutes 13 000 rpm à 4°C Vider le surnageant et laver le culot avec 500 µl d'éthanol à 70 % Centrifuger 5 minutes à 13 000 rpm à 4°C et pipeter le surnageant Laisser le culot sécher à l'air libre sur glace pendant 15 minutes Resuspendre avec de l'eau RNase-free à une concentration de 1 µg/µl.

source_name: WT roots Repet2

extract_protocol: WT roots Repet2:10ug. (Amplification_Ambion.txt) Amplification des ARN messagers (Kit AMBION MessageAmp aRNA Amplification #1750) Le kit se compose de 3 parties : réactifs enzymatiques à -20°C, tampons de purification à 4°C et colonnes à température ambiante. Si les concentrations en ARN sont inférieures à 180 ng/µl, prévoir une précipitation. Transcription inverse A partir d'ARN totaux purifiés et quantifiés au Ribogreen : ARN tot (1µg)+ eau 5.5 µl T7-oligo-dT   0.5 µl Incuber dans le bloc chauffant à 65°C 10min, centrifuger brièvement , puis mettre sur glace. Préparer le Mix (prévoir 5% en plus) en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace :   10X First Strand Buffer :  1µl Ribonuclease Inhibitor :  0.5µl dNTP Mix :    2µl Reverse Transcriptase  0.5µl Ajouter 4 µl de ce mix dans les 6µl d'ARN, agiter légèrement et centrifuger brièvement. Volume final = 10 µl Incuber 2h dans un bain-marie à 42°C Centrifuger brièvement , puis mettre sur glace Allumer le bain-Marie à 16°C dans la chambre froide. Faire un mix dans cet ordre (prévoir 5% en plus) en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace: Eau RNase-Free  31.5µl 10X 2nd Strand Buffer 5µl dNTP Mix    2µl DNA Polymérase  1µl RNase H.     0.5µl Ajouter 40 µl de ce mix aux 10 µl précédents. Volume final = 50 µl. Mélanger par pipetage et centrifuger brièvement. Incuber 2h à 16°C Ajouter 50 µl d'eau DEPC. Possibilité de garder les échantillons après cette étape à -20°C en attendant la purification Purification des cDNA: cette étape doit se faire le plus tard possible Allumer un bain-Marie et le régler à 50 °C. Y mettre l'eau RNase-free à préchauffer. À 4 °C, le Binding Buffer peut avoir cristallisé, il faut bien le redissoudre avant utilisation en le chauffant brièvement au bain marie à 50°C. Equilibrer la colonne: déposer 50 µl de cDNA Binding Buffer sur la colonne cDNA Incuber 5 min à température ambiante. (Ne pas centrifuger) Ajouter 250µl de cDNA Binding Buffer dans les 100µl d'[ADN + eau] Mélanger par pipetage Déposer le tout sur la colonne équilibrée Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube 2 ml Lavage : déposer 500 µl de cDNA Wash Buffer sur la colonne (Vérifier que l'éthanol a bien été ajouté) Centrifuger 1 minute à 10000g à température ambiante Jeter le liquide et centrifuger à nouveau 1 minute à 10 000g afin d'éliminer les traces d'éthanol Transférer colonne dans un tube de 1.5 ml Déposer au milieu de la colonne 5µl d'eau RNase-free à 50°C Incuber 2 minutes à température ambiante et remettre l'eau à 50°C Centrifuger 1,5 minutes à 10000g à température ambiante Répéter l'élution dans le même tube avec 5µl d'eau RNase-free à 50°C et éteindre le bain-marie Transcription in vitro pour la synthèse d'aRNA(prévoir 5% en plus) : Préparer le mix suivant en mettant l'enzyme à la dernière minute, sur glace : 2µl ATP Soln (75mM) 2µl CTP Soln (75mM) 2µl GTP Soln (75mM) 2µl UTP Soln (75mM) 2µl T7 10X réaction Buffer Attention : il peut avoir cristallisé : bien le redissoudre avant utilisation 2µl T7 enzyme Mix Mélanger par pipetage, centrifugation brève Ajouter 12 µl de ce mix dans les 8 µl précédents. Volume final = 20 µl Incuber 14h dans l'étuve "bactério" à 37°C. Rajouter 1 µl de DNase I, mélanger par pipetage, centrifugation brève Incuber 30min dans le bloc chauffant à 37°C. Possibilité de conserver à -20°C avant la purification Ajouter 80 µl "Elution Solution" à l'éluat. Vf = 100µl. Purification des aRNA : Allumer un bain-Marie et le régler à 50 °C. Y mettre l'eau RNase-free à préchauffer. Ajouter aux 100 µl précédents :  350µl aRNA Binding Buffer  250µl EtOH 100%. Mélanger par pipetage et déposer l'échantillon sur le centre de la colonne aRNA Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et replacer la colonne dans le tube de 2 ml Lavage : déposer 650µl aRNA Wash Buffer sur la colonne (Vérifier que l'éthanol a bien été ajouté) Centrifuger 1 minute à 10 000g à température ambiante Jeter le liquide et centrifuger à nouveau 1 minute à 10 000g afin d'éliminer les traces d'éthanol Transférer la colonne dans un tube de 1.5 ml Elution : déposer au milieu de la colonne 50µl d'eau RNase-free à 50°C Incuber 2 minutes à température ambiante et remettre l'eau à 50°C Centrifuger 1,5 minutes à 10 000g à température ambiante Répéter l'élution dans le même tube : Déposer au milieu de la colonne 50µl d'eau RNase-free à 50°C et éteindre le bain-marie Incuber 2 minutes à température ambiante Centrifuger 1,5 minutes à 10 000g à température ambiante Le volume final est entre 90 et 100 µl. Quantification : Préparer une dilution au 1/20 pour chaque échantillon et quantifier au ribogreen. Si la quantité finale est inférieure à 50 µg, vérifier la qualité sur gel (ou puce Bio-Analyser.) Si la concentration est inférieure à 625 ng/µl, prévoir une précipitation pour le marquage : Ajouter 10 µl de Na Acetate 3M, pH 5,2 et 250 µl d'Ethanol 96,2% Précipiter 1 heure à -20°C ou 30 minutes à -80°C Centrifuger 30 minutes 13 000 rpm à 4°C Vider le surnageant et laver le culot avec 500 µl d'éthanol à 70 % Centrifuger 5 minutes à 13 000 rpm à 4°C et pipeter le surnageant Laisser le culot sécher à l'air libre sur glace pendant 15 minutes Resuspendre avec de l'eau RNase-free à une concentration de 1 µg/µl.


title: HMEC_50% confluent_25µg/mL_of_ENP_rep2

source_name: HMEC, 50 % confluent, 25 µg/mL of ENP, replicate 2


title: HMEC_50% confluent_0µg/mL_of_ENP_rep3

description: Gene expression in HMEC at 50 % of confluence after 24 h in absence of ENP exposure (0 µg/mL)

source_name: HMEC, 50 % confluent, 0 µg/mL of ENP, replicate 3


title: 14286380 - WT + 5CHO-THF roots Repet2 vs WT roots Repet2

description: Folates and 1C metabolism

hyb_protocol: WT roots Repet2 Cy5 / WT + 5CHO-THF roots Repet2 Cy3 : 30pmol. (Hybridization_Protocol.txt) Hybridization Protocol: CATMA slides (Corning Microarray Technology, CORNING) are pretreated in the prehybridisation solution (1 % BSA, 0.1 SDS, 5X SSC ) at 42°C for 60 min. They are dipped a couple of times in distilled water at room temperature, then in isopropanol and dried immediately by compressed nitrogen stream. Slides were placed in Corning hybridization chambers with a 25x60 lifterslip and 10ul of distilled water for each groove. The target was diluted to a final volume of 60 µL as follows 15µl of purified, labeled cDNA, 15 µl of 4X Hybridization Buffer ( 20X SDS, 0.4 % SDS), 30 µL formamide. The target mixture is heated for 3 min at 95°C, put on ice for 30 sec and centrifuged to remove dust for 1 min. The target mixture was put on the chip as quickly as possible. The microarray is sealed in a chamber and submerged in a 42°C water bath for approximately 16 h. The microarray is washed for 4 min in 1xSSC, 0.2% SDS (42°C); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC, 0.2% SDS (RT); 4 min in 0.1x SSC (RT); dipped a few times in distilled water and dried immediately by compressed nitrogen stream.


title: HMEC_50% confluent_25µg/mL_of_ENP_rep1

source_name: HMEC, 50 % confluent, 25 µg/mL of ENP, replicate 1


title: plasma from nasopharyngeal carcinoma patient [70A]

description: MicroRNA expression profiles in plasma

value: 53 years


title: plasma from nasopharyngeal carcinoma patient [65A]

description: MicroRNA expression profiles in plasma

value: 37 years


title: HMEC_50% confluent_0µg/mL_of_ENP_rep1

source_name: HMEC, 50 % confluent, 0 µg/mL of ENP, replicate 1

value: mammary epithelial cells

value: female