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type: genomic

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last: Pilsner

state: MI

address: 275 E Hancock St

department: Department of Obstetrics and Gynecology

country: USA

institute: Wayne State University

description:
sperm DNA methylation
Processed_methylation_data_matrix_EARTH.RData

hyb_protocol: bisulphite converted DNA was amplified, fragmented and hybridised to  Illumina Infinium HumanMethylationEPIC BeadChip using standard Illumina protocol

scan_protocol: Arrays were imaged using BeadArray Reader using standard recommended Illumina scanner setting

data_processing:
Sperm DNA methylation was assessed using Illumina's EPIC Infinium Methylation Beadchip. Raw idat files were imported into R and within-array normalization and dye-bias equalization of Type I and Type II probes was performed using normal-exponential convolution method (Noob) via  minfi package. Batch effects were corrected with the ComBat function in the sva package while cross-hybridizing probes were removed using the DMRcate package. probes with detection pvalue >0.01 were also exluced prior to downstream analysis.
Processed matrix contains the NOOB-normalized beta values representing the percent CpG methylation for all the CpGs that passed the preprocessing method.

molecule: genomic DNA

organism: Homo sapiens

source_name: normal sperm sample

label_protocol: Standard Illumina Protocol

extract_protocol: Standard Illumina Protocol

treatment_protocol: Sperm from semen was extracted using gradient method and purified DNA was isolated our previously developed method of beads, RLT and TCEPS

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type: SRA

city: San Francisco

first: Alexander

last: Marson

state: CA

address: 1650 Owens St

institute: UCSF Gladstone Institutes

library_source: genomic

data_processing:
Bcl2fastq (v2.19) with the settings --minimum-trimmed-read-length 8 was used to generate fastqs.
the fastqs were trimmed with cutadapt (v1.18)
Bowtie2 (v2.2.5) was used to align the trimmed fastqs to GRCh38 using settings --local --very-sensitive --no-mixed --no-discordant --phred33 --dovetail -I 10 -X 700 -p 8 -q and E. coli (EMBL accession U00096.2) with settings --local --very-sensitive --no-overlap --no-dovetail --no-mixed --no-discordant --phred33 -I 10 -X 700 -p 8 -q.
Bam files were generated with samtools(version 1.9) view -bS -F 0x04 and bam to bed conversion performed with bedtools (v2.30.0) bamtobed -bedpe.
Bedfiles were filtered to include only paired reads of less than 1000 bp with the command awk '$1==$4 && $6-$2 < 1000 {print $0}' samplename.bed before generating bedgraph files using bedtools (version 2.30.0) genomecov -bg.
Peak calling was performed using the bedgraph files as input with SEACR49 (v1.3). Each H3K27ac bed file was compared to the respective donor and KO condition IgG file to identify peaks about the background using the norm and stringent options.
ChIP-seq blacklist regions were removed from filtered SEACR files prior to generating the sample by peak matrix
The sample matrix was reduced across all peaks within the dataset and segmented into regions of 5000 bps.
Assembly: GRCh38
Supplementary files format and content: Scaled bedgraphs are provided for H3K27ac samples and unscaled bedgraphs for IgG control samples
Supplementary files format and content: SEACR peaks are provided for H3K27ac samples
Library strategy: CUT&RUN

source_name: Lymphocyte

growth_protocol: CD4+ regulatory and effector T cells were isolated from fresh Peripheral Blood Leukopaks (STEMCELL Technologies, #70500) from healthy human donors, after institutional review board–approved informed written consent (STEMCELL Technologies). The contents of the Leukopaks were washed twice with a 1X volume of EasySep buffer (DPBS, 2% fetal Bovine Serum (FBS), 1mM pH 8.0 EDTA) using centrifugation. The washed cells were resuspended at 200E6 cells/mL in EasySep buffer and isolated with the EasySep™ Human CD4+CD127lowCD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit (STEMCELL Technologies, #18063), according to the manufacturer’s protocol. Following isolation with the kit, Tregs were stained Alexa Fluor® 647 anti-human CD25 Antibody (Biolegend, #302618), PE anti-Human CD127 (Beckon Dickinson, #557938), and Pacific Blue™ anti-human CD4 Antibody (Biolegend, #344620) and isolated using FACS to ensure a pure population without contaminating effector cells. After sorting pure CD4+CD127lowCD25+ Regulatory T Cells, the cells were seeded at 1x106 cells/mL in XVIVO-15 (Lonza, #02-053Q) supplemented with 55 uM 2-mercaptoethanol, 4 mM N-acetyl L-cysteine, and 200 U/mL IL-2 (Amerisource Bergen, #10101641). Teffs were seeded at 1x106 cells/mL in RPMI-1640 supplemented with 10% FCS, 2 mM L-Glutamine (Fisher Scientific #25030081), 10 mM HEPES (Sigma, #H0887-100ML), 1X MEM Non-essential Amino Acids (Fisher, #11140050), 1 mM Sodium Pyruvate (Fisher Scientific #11360070), 100 U/mL Penicillin-Streptomycin (Sigma, #P4333-100ML), and 50 U/mL IL-2 (Amerisource Bergen, #10101641). Both cell subsets were then stimulated with ImmunoCult™ Human CD3/CD28/CD2 T Cell Activator (STEMCELL Technologies, #10990) at 25 uL/mL for Tregs and 6.25 uL/mL for Teff. Following activation and electroporation, cells were split 1:2 every 48 hours to maintain an approximate density of 1x106 cells/mL and supplemented with respective doses of IL-2.

extract_protocol:
CUT&RUN from isolated nuclei was performed according to the manufacturer’s protocol with the EpiCypher CUTANA™ ChIC/CUT&RUN Kit and provided reagents. In brief, 5E5 T cells per reaction  were washed with PBS before nuclear isolation using the EpiCypher recommended lysis buffer consisting of 20 mM HEPES pH 7.9 (Sigma-Aldrich), 10 mM KCl (Sigma-Aldrich), 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich), 20% Glycerol (Sigma-Aldrich), 1 mM MnCl2 (Sigma-Aldrich), 1X cOmplete Mini-Tablet (Roche), and 0.5 mM Spermidine (Sigma-Aldrich). The cells were resuspended in 100 ul per reaction cold nuclear extraction buffer and incubated on ice for 10 minutes. Following lysis, nuclei were pelleted and resuspended in 100 ul per reaction of nuclear extraction buffer. The isolated nuclei were then frozen at -80 in extraction buffer until DNA isolation. After thawing the samples at 37C, the nuclei were bound to activated conA beads. After adsorption of nuclei to beads, permeabilization was performed with 0.01% digitonin containing buffer. Antibodies for H3K27ac (EpiCypher) and IgG (EpiCypher) were added at 500 ng per reaction. Following overnight antibody binding, pAG-MNase addition, and chromatin cleavage, 0.5 ng of the provided E. coli DNA was added to each sample following chromatin cleavage by MNase. The provided spin columns and buffers were used for DNA isolation and purification.
The resulting DNA was prepared for sequencing using the CUTANA™ CUT&RUN Library Prep Kit (Cat 141002) according to the manufacturer’s protocol.

treatment_protocol: Stimulated cells were activated with ImmunoCult™ Human CD3/CD28/CD2 T Cell Activator (STEMCELL Technologies, #10990) 48 hours prior to collection

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