title: Functional roles of H98 and W99 and β2α2 loop dynamics in the α-l-arabinofuranosidase from Thermobacillus xylanilyticus.
abstract: This study is focused on the elucidation of the functional role of the mobile β2α2 loop in the α-L-arabinofuranosidase from Thermobacillus xylanilyticus, and particularly on the roles of loop residues H98 and W99. Using site-directed mutagenesis, coupled to characterization methods including isothermal titration calorimetry (ITC) and saturation transfer difference nuclear magnetic resonance (STD-NMR) spectroscopy, and molecular dynamics simulations, it has been possible to provide a molecular level view of interactions and the consequences of mutations. Binding of para-nitrophenyl α-L-arabinofuranoside (pNP-α-l-Araf) to the wild-type arabinofuranosidase was characterized by K(d) values (0.32 and 0.16 mm, from ITC and STD-NMR respectively) that highly resembled that of the arabinoxylo-oligosaccharide XA(3)XX (0.21 mm), and determination of the thermodynamic parameters of enzyme : pNP-α-L-Araf binding revealed that this process is driven by favourable entropy, which is linked to the movement of the β2α2 loop. Loop closure relocates the solvent-exposed W99 into a buried location, allowing its involvement in substrate binding and in the formation of a functional active site. Similarly, the data underline the role of H98 in the ‘dynamic’ formation and definition of a catalytically operational active site, which may be a specific feature of a subset of GH51 arabinofuranosidases. Substitution of H98 and W99 by alanine or phenylalanine revealed that mutations affected K(M) and/or k(cat). Molecular dynamics performed on W99A implied that this mutation causes the loss of a hydrogen bond and leads to an alternative binding mode that is detrimental for catalysis. STD-NMR experiments revealed altered binding of the aglycon motif in the active site, combined with reduced STD intensities of the α-L-arabinofuranosyl moiety for W99 substitutions.
authors:  Université de Toulouse, INSA, UPS, INP, Toulouse, France INRA, UMR792, Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, Toulouse, France CNRS, LISBP UMR5504, Toulouse, France Agence de l'environnement et de la Maîtrise de l'Energie, Angers, France CNRS, IPBS UMR5089, Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, Toulouse, France Université de Versailles St Quentin-en-Yvelines, Institut de Génétique et Microbiologie, Faculté des Sciences Paris-Sud, Orsay, France.
authors: Faten
authors: F
authors: Arab-Jaziri
authors:  Université de Toulouse, INSA, UPS, INP, Toulouse, France INRA, UMR792, Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, Toulouse, France CNRS, LISBP UMR5504, Toulouse, France Agence de l'environnement et de la Maîtrise de l'Energie, Angers, France CNRS, IPBS UMR5089, Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, Toulouse, France Université de Versailles St Quentin-en-Yvelines, Institut de Génétique et Microbiologie, Faculté des Sciences Paris-Sud, Orsay, France.
authors: Bastien
authors: B
authors: Bissaro
authors:  Université de Toulouse, INSA, UPS, INP, Toulouse, France INRA, UMR792, Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, Toulouse, France CNRS, LISBP UMR5504, Toulouse, France Agence de l'environnement et de la Maîtrise de l'Energie, Angers, France CNRS, IPBS UMR5089, Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, Toulouse, France Université de Versailles St Quentin-en-Yvelines, Institut de Génétique et Microbiologie, Faculté des Sciences Paris-Sud, Orsay, France.
authors: Sophie
authors: S
authors: Barbe
authors:  Université de Toulouse, INSA, UPS, INP, Toulouse, France INRA, UMR792, Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, Toulouse, France CNRS, LISBP UMR5504, Toulouse, France Agence de l'environnement et de la Maîtrise de l'Energie, Angers, France CNRS, IPBS UMR5089, Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, Toulouse, France Université de Versailles St Quentin-en-Yvelines, Institut de Génétique et Microbiologie, Faculté des Sciences Paris-Sud, Orsay, France.
authors: Olivier
authors: O
authors: Saurel
authors:  Université de Toulouse, INSA, UPS, INP, Toulouse, France INRA, UMR792, Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, Toulouse, France CNRS, LISBP UMR5504, Toulouse, France Agence de l'environnement et de la Maîtrise de l'Energie, Angers, France CNRS, IPBS UMR5089, Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, Toulouse, France Université de Versailles St Quentin-en-Yvelines, Institut de Génétique et Microbiologie, Faculté des Sciences Paris-Sud, Orsay, France.
authors: Hélène
authors: H
authors: Débat
authors:  Université de Toulouse, INSA, UPS, INP, Toulouse, France INRA, UMR792, Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, Toulouse, France CNRS, LISBP UMR5504, Toulouse, France Agence de l'environnement et de la Maîtrise de l'Energie, Angers, France CNRS, IPBS UMR5089, Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, Toulouse, France Université de Versailles St Quentin-en-Yvelines, Institut de Génétique et Microbiologie, Faculté des Sciences Paris-Sud, Orsay, France.
authors: Claire
authors: C
authors: Dumon
authors:  Université de Toulouse, INSA, UPS, INP, Toulouse, France INRA, UMR792, Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, Toulouse, France CNRS, LISBP UMR5504, Toulouse, France Agence de l'environnement et de la Maîtrise de l'Energie, Angers, France CNRS, IPBS UMR5089, Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, Toulouse, France Université de Versailles St Quentin-en-Yvelines, Institut de Génétique et Microbiologie, Faculté des Sciences Paris-Sud, Orsay, France.
authors: Virginie
authors: V
authors: Gervais
authors:  Université de Toulouse, INSA, UPS, INP, Toulouse, France INRA, UMR792, Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, Toulouse, France CNRS, LISBP UMR5504, Toulouse, France Agence de l'environnement et de la Maîtrise de l'Energie, Angers, France CNRS, IPBS UMR5089, Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, Toulouse, France Université de Versailles St Quentin-en-Yvelines, Institut de Génétique et Microbiologie, Faculté des Sciences Paris-Sud, Orsay, France.
authors: Alain
authors: A
authors: Milon
authors:  Université de Toulouse, INSA, UPS, INP, Toulouse, France INRA, UMR792, Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, Toulouse, France CNRS, LISBP UMR5504, Toulouse, France Agence de l'environnement et de la Maîtrise de l'Energie, Angers, France CNRS, IPBS UMR5089, Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, Toulouse, France Université de Versailles St Quentin-en-Yvelines, Institut de Génétique et Microbiologie, Faculté des Sciences Paris-Sud, Orsay, France.
authors: Isabelle
authors: I
authors: André
authors:  Université de Toulouse, INSA, UPS, INP, Toulouse, France INRA, UMR792, Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, Toulouse, France CNRS, LISBP UMR5504, Toulouse, France Agence de l'environnement et de la Maîtrise de l'Energie, Angers, France CNRS, IPBS UMR5089, Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, Toulouse, France Université de Versailles St Quentin-en-Yvelines, Institut de Génétique et Microbiologie, Faculté des Sciences Paris-Sud, Orsay, France.
authors: Régis
authors: R
authors: Fauré
authors:  Université de Toulouse, INSA, UPS, INP, Toulouse, France INRA, UMR792, Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés, Toulouse, France CNRS, LISBP UMR5504, Toulouse, France Agence de l'environnement et de la Maîtrise de l'Energie, Angers, France CNRS, IPBS UMR5089, Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale, Toulouse, France Université de Versailles St Quentin-en-Yvelines, Institut de Génétique et Microbiologie, Faculté des Sciences Paris-Sud, Orsay, France.
authors: Michael J
authors: MJ
authors: O'Donohue
mesh_terms: D000595:Amino Acid Sequence; D001406:Bacillaceae / Q000201:enzymology* / Q000235:genetics; D001665:Binding Sites; D002384:Catalysis; D020134:Catalytic Domain; D018360:Crystallography, X-Ray; D006026:Glycoside Hydrolases / Q000737:chemistry* / Q000235:genetics / Q000378:metabolism*; D006859:Hydrogen / Q000737:chemistry / Q000378:metabolism*; D008958:Models, Molecular; D008969:Molecular Sequence Data; D016297:Mutagenesis, Site-Directed; D009154:Mutation / Q000235:genetics; D019906:Nuclear Magnetic Resonance, Biomolecular; D010649:Phenylalanine / Q000235:genetics / Q000378:metabolism*; D017434:Protein Structure, Tertiary; D011994:Recombinant Proteins / Q000737:chemistry / Q000235:genetics / Q000378:metabolism; D017386:Sequence Homology, Amino Acid; D013379:Substrate Specificity; D013816:Thermodynamics
chemical_list: D011994:Recombinant Proteins; D010649:Phenylalanine; D006859:Hydrogen; D006026:Glycoside Hydrolases; C019713:alpha-N-arabinofuranosidase