Leishmania infantum ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase-2 is an apyrase involved in macrophage infection and expressed in infected dogs.
BACKGROUND
Visceral leishmaniasis is an important tropical disease, and Leishmania infantum chagasi (synonym of Leishmania infantum) is the main pathogenic agent of visceral leishmaniasis in the New World. Recently, ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases) were identified as enablers of infection and virulence factors in many pathogens. Two putative E-NTPDases (∼70 kDa and ∼45 kDa) have been found in the L. infantum genome. Here, we studied the ∼45 kDa E-NTPDase from L. infantum chagasi to describe its natural occurrence, biochemical characteristics and influence on macrophage infection.


RESULTS
We used live L. infantum chagasi to demonstrate its natural ecto-nucleotidase activity. We then isolated, cloned and expressed recombinant rLicNTPDase-2 in bacterial system. The recombinant rLicNTPDase-2 hydrolyzed a wide variety of triphosphate and diphosphate nucleotides (GTP> GDP  =  UDP> ADP> UTP  =  ATP) in the presence of calcium or magnesium. In addition, rLicNTPDase-2 showed stable activity over a pH range of 6.0 to 9.0 and was partially inhibited by ARL67156 and suramin. Microscopic analyses revealed the presence of this protein on cell surfaces, vesicles, flagellae, flagellar pockets, kinetoplasts, mitochondria and nuclei. The blockade of E-NTPDases using antibodies and competition led to lower levels of parasite adhesion and infection of macrophages. Furthermore, immunohistochemistry showed the expression of E-NTPDases in amastigotes in the lymph nodes of naturally infected dogs from an area of endemic visceral leishmaniasis.


CONCLUSIONS
In this work, we cloned, expressed and characterized the NTPDase-2 from L. infantum chagasi and demonstrated that it functions as a genuine enzyme from the E-NTPDase/CD39 family. We showed that E-NTPDases are present on the surface of promastigotes and in other intracellular locations. We showed, for the first time, the broad expression of LicNTPDases in naturally infected dogs. Additionally, the blockade of NTPDases led to lower levels of in vitro adhesion and infection, suggesting that these proteins are possible targets for rational drug design.
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais, Brazil; Instituto Nacional de Biotecnologia Estrutural e Química Medicinal em Doenças Infecciosas (INBEQMeDI), São Carlos, São Paulo, Brazil.
Raphael De Souza
Rde S
Vasconcellos
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais, Brazil; Instituto Nacional de Biotecnologia Estrutural e Química Medicinal em Doenças Infecciosas (INBEQMeDI), São Carlos, São Paulo, Brazil.
Christiane
C
Mariotini-Moura
Departamento de Ciências Biológicas - ICEB/, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Minas Gerais, Brazil.
Rodrigo Saar
RS
Gomes
Departamento de Ciências Biológicas - ICEB/, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro Preto, Minas Gerais, Brazil.
Tiago Donatelli
TD
Serafim
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais, Brazil.
Rafaela de Cássia
Rde C
Firmino
Instituto Nacional de Biotecnologia Estrutural e Química Medicinal em Doenças Infecciosas (INBEQMeDI), São Carlos, São Paulo, Brazil; Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais, Brazil.
Matheus
M
Silva E Bastos
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais, Brazil.
Felipe Freitas de
FF
Castro
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais, Brazil.
Claudia Miranda de
CM
Oliveira
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais, Brazil.
Lucas
L
Borges-Pereira
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais, Brazil.
Anna Cláudia Alves
AC
de Souza
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais, Brazil.
Ronny Francisco
RF
de Souza
Departamento de Veterinária, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais, Brazil.
Gabriel Andres Tafur
GA
Gómez
Centro de Zoonoses de Governador Valadares, Governador Valadares, Minas Gerais, Brazil.
Aimara da Costa
Ada C
Pinheiro
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais, Brazil; Núcleo de Bioinformática, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais, Brazil.
Talles Eduardo Ferreira
TE
Maciel
Departamento de Veterinária, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais, Brazil.
Abelardo
A
Silva-Júnior
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais, Brazil.
Gustavo Costa
GC
Bressan
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais, Brazil.
Márcia Rogéria
MR
Almeida
Departamento de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, São Paulo, Brazil.
Munira Muhammad Abdel
MM
Baqui
Instituto Nacional de Biotecnologia Estrutural e Química Medicinal em Doenças Infecciosas (INBEQMeDI), São Carlos, São Paulo, Brazil.
Luís Carlos Crocco
LC
Afonso
Instituto Nacional de Biotecnologia Estrutural e Química Medicinal em Doenças Infecciosas (INBEQMeDI), São Carlos, São Paulo, Brazil; Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais, Brazil.
Juliana Lopes Rangel
JL
Fietto
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