A novel mechanism of functional cooperativity regulation by thiol redox status in a dimeric inorganic pyrophosphatase.
Inorganic PPases are essential metal-dependent enzymes that convert pyrophosphate into orthophosphate. This reaction is quite exergonic and provides a thermodynamic advantage for many ATP-driven biosynthetic reactions. We have previously demonstrated that cytosolic PPase from R. microplus embryos is an atypical Family I PPase. Here, we explored the functional role of the cysteine residues located at the homodimer interface, its redox sensitivity, as well as structural and kinetic parameters related to thiol redox status.



In this work, we used prokaryotic expression system for recombinant protein overexpression, biochemical approaches to assess kinetic parameters, ticks embryos and computational approaches to analyze and predict critical amino acids as well as physicochemical properties at the homodimer interface.



Cysteine 339, located at the homodimer interface, was found to play an important role in stabilizing a functional cooperativity between the two catalytic sites, as indicated by kinetics and Hill coefficient analyses of the WT-rBmPPase. WT-rBmPPase activity was up-regulated by physiological antioxidant molecules such as reduced glutathione and ascorbic acid. On the other hand, hydrogen peroxide at physiological concentrations decreased the affinity of WT-rBmPPase for its substrate (PPi), probably by inducing disulfide bridge formation.



Our results provide a new angle in understanding redox control by disulfide bonds formation in enzymes from hematophagous arthropods. The reversibility of the down-regulation is dependent on hydrophobic interactions at the dimer interface.



This study is the first report on a soluble PPase where dimeric cooperativity is regulated by a redox mechanism, according to cysteine redox status.
Laboratório de Química e Função de Proteínas e Peptídeos, Laboratório de Biologia Tecidual e Celular and Unidade de Experimentação Animal, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Brazil.
Evenilton P
EP
Costa
Laboratório de Química e Função de Proteínas e Peptídeos, Laboratório de Biologia Tecidual e Celular and Unidade de Experimentação Animal, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Brazil.
Arnoldo R
AR
Façanha
Laboratório de Química e Função de Proteínas e Peptídeos, Laboratório de Biologia Tecidual e Celular and Unidade de Experimentação Animal, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Brazil; Laboratório Integrado de Bioquímica Hatisaburo Masuda, Laboratório Integrado de Computação Científica, Núcleo de Pesquisas em Ecologia e Desenvolvimento Sócio-Ambiental de Macaé (NUPEM), Universidade Federal do Rio de Janeiro, Macaé, Brazil.
Criscila S
CS
Cruz
Laboratório de Química e Função de Proteínas e Peptídeos, Laboratório de Biologia Tecidual e Celular and Unidade de Experimentação Animal, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Brazil.
Jhenifer N
JN
Silva
Laboratório de Química e Função de Proteínas e Peptídeos, Laboratório de Biologia Tecidual e Celular and Unidade de Experimentação Animal, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Brazil.
Josias A
JA
Machado
Laboratório de Química e Função de Proteínas e Peptídeos, Laboratório de Biologia Tecidual e Celular and Unidade de Experimentação Animal, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Brazil.
Gabriel M
GM
Carvalho
Laboratório de Química e Função de Proteínas e Peptídeos, Laboratório de Biologia Tecidual e Celular and Unidade de Experimentação Animal, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Brazil.
Mariana R
MR
Fernandes
Laboratório de Química e Função de Proteínas e Peptídeos, Laboratório de Biologia Tecidual e Celular and Unidade de Experimentação Animal, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Brazil.
Renato
R
Martins
Laboratório Integrado de Bioquímica Hatisaburo Masuda, Laboratório Integrado de Computação Científica, Núcleo de Pesquisas em Ecologia e Desenvolvimento Sócio-Ambiental de Macaé (NUPEM), Universidade Federal do Rio de Janeiro, Macaé, Brazil.
Eldo
E
Campos
Laboratório Integrado de Bioquímica Hatisaburo Masuda, Laboratório Integrado de Computação Científica, Núcleo de Pesquisas em Ecologia e Desenvolvimento Sócio-Ambiental de Macaé (NUPEM), Universidade Federal do Rio de Janeiro, Macaé, Brazil.
Nelilma C
NC
Romeiro
Tick Unit, International Livestock Research Institute, P.O. Box 30709, Nairobi, Kenya.
Naftaly W
NW
Githaka
Laboratory of Infectious Diseases, Department of Disease Control, Graduate School of Veterinary Medicine, Hokkaido University, Japan.
Satoru
S
Konnai
Laboratory of Infectious Diseases, Department of Disease Control, Graduate School of Veterinary Medicine, Hokkaido University, Japan.
Kazuhiko
K
Ohashi
Faculdade de Veterinária e Centro de Biotecnologia do Estado do Rio Grande do Sul, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Brazil.
Itabajara S
IS
Vaz
Laboratório de Química e Função de Proteínas e Peptídeos, Laboratório de Biologia Tecidual e Celular and Unidade de Experimentação Animal, Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, Brazil. Electronic address: logullo@uenf.br.
Carlos
C
Logullo
D000596:Amino Acids / Q000378:metabolism; D000818:Animals; D002118:Calcium / Q000494:pharmacology; D004220:Disulfides / Q000378:metabolism; D004591:Electrophoresis, Polyacrylamide Gel; D005459:Fluorides / Q000494:pharmacology; D019803:Glutathione Disulfide / Q000378:metabolism; D057927:Hydrophobic and Hydrophilic Interactions; D043564:Inorganic Pyrophosphatase / Q000378:metabolism*; D007700:Kinetics; D008958:Models, Molecular; D016297:Mutagenesis, Site-Directed; D050505:Mutant Proteins / Q000378:metabolism; D016877:Oxidants / Q000494:pharmacology; D010084:Oxidation-Reduction; D055503:Protein Multimerization / Q000187:drug effects; D011994:Recombinant Proteins / Q000378:metabolism; D019163:Reducing Agents / Q000494:pharmacology; D013438:Sulfhydryl Compounds / Q000378:metabolism*; D013987:Ticks / Q000201:enzymology*
D000596:Amino Acids; D004220:Disulfides; D050505:Mutant Proteins; D016877:Oxidants; D011994:Recombinant Proteins; D019163:Reducing Agents; D013438:Sulfhydryl Compounds; D043564:Inorganic Pyrophosphatase; D005459:Fluorides; D002118:Calcium; D019803:Glutathione Disulfide
Cooperativity; Disulfide bond formation; Embryogenesis; Metabolism; Pyrophosphatase; Thiol redox status