title: Characterisation of iunH gene knockout strain from Mycobacterium tuberculosis.
abstract: BACKGROUND
  Tuberculosis (TB) is an infectious disease caused mainly by the bacillus Mycobacterium tuberculosis. The better understanding of important metabolic pathways from M. tuberculosis can contribute to the development of novel therapeutic and prophylactic strategies to combat TB. Nucleoside hydrolase (MtIAGU-NH), encoded by iunH gene (Rv3393), is an enzyme from purine salvage pathway in M. tuberculosis. MtIAGU-NH accepts inosine, adenosine, guanosine, and uridine as substrates, which may point to a pivotal metabolic role.
  
  
  OBJECTIVE
  Our aim was to construct a M. tuberculosis knockout strain for iunH gene, to evaluate in vitro growth and the effect of iunH deletion in M. tuberculosis in non-activated and activated macrophages models of infection.
  
  
  METHODS
  A M. tuberculosis knockout strain for iunH gene was obtained by allelic replacement, using pPR27xylE plasmid. The complemented strain was constructed by the transformation of the knockout strain with pNIP40::iunH. MtIAGU-NH expression was analysed by Western blot and LC-MS/MS. In vitro growth was evaluated in Sauton's medium. Bacterial load of non-activated and interferon-γ activated RAW 264.7 cells infected with knockout strain was compared with wild-type and complemented strains.
  
  
  RESULTS
  Western blot and LC-MS/MS validated iunH deletion at protein level. The iunH knockout led to a delay in M. tuberculosis growth kinetics in Sauton's medium during log phase, but did not affect bases and nucleosides pool in vitro. No significant difference in bacterial load of knockout strain was observed when compared with both wild-type and complemented strains after infection of non-activated and interferon-γ activated RAW 264.7 cells.
  
  
  CONCLUSIONS
  The disruption of iunH gene does not influence M. tuberculosis growth in both non-activated and activated RAW 264.7 cells, which show that iunH gene is not important for macrophage invasion and virulence. Our results indicated that MtIAGU-NH is not a target for drug development.
authors.affiliation: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Centro de Pesquisas em Biologia Molecular e Funcional, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Tuberculose, Porto Alegre, RS, Brasil.
authors.forename: Anne Drumond
authors.initials: AD
authors.lastname: Villela
authors.affiliation: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Centro de Pesquisas em Biologia Molecular e Funcional, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Tuberculose, Porto Alegre, RS, Brasil.|Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Programa de Pós-Graduação em Medicina e Ciências da Saúde, Porto Alegre, RS, Brasil.|Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Instituto de Toxicologia e Farmacologia, Porto Alegre, RS, Brasil.
authors.forename: Valnês da Silva
authors.initials: VD
authors.lastname: Rodrigues
authors.affiliation: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Centro de Pesquisas em Biologia Molecular e Funcional, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Tuberculose, Porto Alegre, RS, Brasil.
authors.forename: Antônio Frederico Michel
authors.initials: AF
authors.lastname: Pinto
authors.affiliation: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Centro de Pesquisas em Biologia Molecular e Funcional, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Tuberculose, Porto Alegre, RS, Brasil.|Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Porto Alegre, RS, Brasil.
authors.forename: Priscila Lamb
authors.initials: PL
authors.lastname: Wink
authors.affiliation: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Centro de Pesquisas em Biologia Molecular e Funcional, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Tuberculose, Porto Alegre, RS, Brasil.|Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Porto Alegre, RS, Brasil.
authors.forename: Zilpa Adriana
authors.initials: ZA
authors.lastname: Sánchez-Quitian
authors.affiliation: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Centro de Pesquisas em Biologia Molecular e Funcional, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Tuberculose, Porto Alegre, RS, Brasil.
authors.forename: Guilherme Oliveira
authors.initials: GO
authors.lastname: Petersen
authors.affiliation: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Programa de Pós-Graduação em Medicina e Ciências da Saúde, Porto Alegre, RS, Brasil.|Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Instituto de Toxicologia e Farmacologia, Porto Alegre, RS, Brasil.|Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Porto Alegre, RS, Brasil.
authors.forename: Maria Martha
authors.initials: MM
authors.lastname: Campos
authors.affiliation: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Centro de Pesquisas em Biologia Molecular e Funcional, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Tuberculose, Porto Alegre, RS, Brasil.|Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Programa de Pós-Graduação em Medicina e Ciências da Saúde, Porto Alegre, RS, Brasil.|Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Porto Alegre, RS, Brasil.
authors.forename: Luiz Augusto
authors.initials: LA
authors.lastname: Basso
authors.affiliation: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Centro de Pesquisas em Biologia Molecular e Funcional, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Tuberculose, Porto Alegre, RS, Brasil.|Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Porto Alegre, RS, Brasil.
authors.forename: Diógenes Santiago
authors.initials: DS
authors.lastname: Santos
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