GSM3069889: RNAseq_aB72h_br1_tr2; Mus musculus; RNA-Seq
mRNA isolation: Extract total RNA using Trizol. Using at least 10μg of total  RNA and extract mRNA with Invitrogen Dynabeads mRNA Purification kit  [cat610.06].  Run the mRNA sample through the beads twice to eliminate rRNA  Contamination (this is critical). Elute mRNA in 15ul of TE and take an OD.  mRNA Fragmentation: Fragment 100ng mRNA with 1μl of 10X Fragmentation  Solution [Ambion cat#AM8740].  Incubate at 70C for 5 minutes using a PCR  thermocycler.  Quench with 1μl of Stop Solution [Ambion cat9264G] and incubate  on ice. Purifiy fragmentation reaction using G‐50 Sephadex Quick Spin Columns  (Roche, cat#11 274 015 001). Speed‐Vac concentrate to approximately 10μl  1st Strand synthesis: Follow SuperScript III First Strand Kit [Invitrogen  cat#18080‐051] protocol for 1st Strand Synthesis but using 3μg/μl of Random  Primers.   2nd Strand Synthesis: Add 61µL of H2O to the first strand cDNA synthesis mix.  Add 10µl of 10× second strand buffer (500 mM Tris‐HCl pH7.8, 50 mM MgCl2, 10  mM DTT) and 3µl of dNTP mix (10 mM). Mix well and incubate on ice for 5 minutes.  Add 1µl of RNaseH (2U/µL, Invitrogen, #18021‐014) and 5µl of DNA Pol I (10U/µL,  Invitrogen, #18010‐025). Mix well and incubate at 16°C in a thermocycler for 2.5  hours. Cleanup the reaction using a Qiagen's MiniElute column.  Wash with 5  volumes of PBI buffer and elute with 30µl of warm (50°C) elution buffer (provided  with the kit).  Blunt Ends: Follow Epicentre End‐It end repair kit (ER0720) to generate blunt  ends  o 1‐34 µl DNA (100 ng or less) + H2O  o 5 µl 10x End repair buffer  o 5 µl 2.5 mM each dNTP  o 5 µl 10 mM ATP  o 1 µl Enzyme mix  Incubate at RT for 45 minutes and cleanup the reaction with a MiniElute  column.  Wash with 5 volumes of PBI buffer and elute with 30ul of warm  (50°C) elution buffer.  PolyA synthesis:  o 30 µl of DNA  o 9.5 µl of H2O o 5 µl of Taq buffer   o 1.5 µl of 50 mM MgCl2   o 1 µl of 10 mM ATP   o 3 µl of Taq DNA polymerase (5u/µl, Invitrogen, cat10342‐020)   Incubate at 70°C for 40 minutes in thermocycler. Cleanup the reaction using a   Qiagen's MiniElute column.  Wash with 5 volumes of PBI buffer and elute   with 15µl of warm (50°C) elution buffer.   Oligo Adapter Ligation:  o 15 µl DNA   o 2 µl H2O   o 2.5 µl 10x T4 DNA ligase buffer   o 3 µl Adapter Oligo Mix (Solexa)   o 2.5 µl T4 DNA ligase (400000 u/ml, NEB)   Incubate at RT O/N   cDNA Purification:  Cleanup the reaction with a MiniElute column.  Wash with 5 volumes of PBI buffer   and elute with 20µl of warm (50°C) elution buffer. Add 5µl of 5X loading dye, and   loaded on a 2% agarose long gel.  Run at 120V for 7 hours. Under the blue light, cut   the invisible 200bp band. Isolate using Qiagen's gel extraction kit.  Elude the DNA   with 11.5ul of warm elution buffer.    PCR Amplification  o 10.5 µl of DNA    o 12.5 µl of master mix (Phusion polymerase from Solexa kit)   o 1 µl of PCR primer 1(2x diluted)   o 1 µl of PCR primer 2(2x diluted)   o 15 cycles of 98˚C for 30 s and 98˚C 10 s, 65˚C 30 s and 72˚C 30 s   o 5 minutes at 72˚C   Cleanup reaction with PCR purification kit (minielute).  Use 5 volumes of PBI buffer   and eluded with 15µl of warm (50˚C) elution buffer. PCR products can be stored at   4C   Pico‐Green Quantification  Use Picogreen to quantify the amount of DNA and validate the purity of the library   using Agilent DNA 1000 [Cat#5067‐1504]. Dilute DNA to a concentration of 10nM   using 0.1%Tween in Qiagen's elution buffer. Store DNA at ‐20C until Solexa analysis.  mRNA-seq: 50 cycles of single-end and paired end sequencing data were acquired on Genome Analyzer II (Illumina)
GEO Accession
GSM3069889